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tzaixmc木虫 (正式写手)
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基因克隆表达中信号肽的问题
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| 我最近想在大肠杆菌BL21中表达其他细菌的蛋白，用pet系列的载体。我的目的基因自身带有一段信号肽序列，我的目的是检测这种蛋白具有目的活性就行（不管是分泌型的还是不分泌的）。我想问的是我要设计引物的时候要去掉信号肽的部分吗？我可不可以选不带有信号肽的pet载体，把目的基因自身的信号肽也一起克隆进去？如果克隆进去的信号肽不能被切除是否会影响蛋白的活性？ |
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 分子问题及解决方案汇总 | 【分子生物】EPI帖 |
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tzaixmc
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还有一个问题就是以pet24为例，有关转录起始和终止位点，翻译起始和终止位点。 1.转录肯定是从T7 promoter那儿开始的吧？ 2.那转录有终止吗？细菌好像是单顺反子吧？ 3。翻译是在Nde Ⅰ那儿的ATG开始吧？我如果在BamH Ⅰ和Xh Ⅰ之间插入一段带有ATG位点的基因，也还是从Nde Ⅰ那儿的ATG开始翻译吧？ 4.我如果在BamH Ⅰ和Xh Ⅰ之间插入一段不带有TAA终止密码子的基因片段，那么是不是就是在T7 terminator的TAA终止翻译啊？那我的片段如果带有TAA终止密码子的话翻译就直接在我的插入片段的TAA这儿终止了吗？ 5.如果我想表达一段经分析带有信号肽的序列，我想除去信号肽的同时又不想带上载体的标签，我应该怎么做？是以除去信号肽后的第一个氨基酸的密码子开始设计带有Nde Ⅰ酶切位点的正向引物，再设计带有TAA终止密码子的并有合适酶切位点的反向引物来扩增插入片段吗？ |
5楼2012-09-03 19:57:54
lidonghong
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2楼2012-09-02 22:08:03
tzaixmc
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3楼2012-09-03 09:55:21
lxj341401
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1、信号肽最好去掉，没有去掉的话很大的可能表达出来是没有活力的，因为宿主不能识别这个信号肽序列，不会把信号肽切割，表达出来的是带信号肽的蛋白，不是你要的成熟蛋白，对活性一般是有影响的。 2、不一定要选择带信号肽的质粒，你如果要让蛋白分泌的话可以选择pet20等，如果如果想融合表达的话pet32、39都可以，如果没有这些要求，pet28是个不错的选择。 |
4楼2012-09-03 10:01:37
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