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【推荐】973 三维培养干细胞自我更新与定向分化的调控网络 已有8人参与
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项目名称： 三维培养干细胞自我更新与定向分化的调控网络 首席科学家： 戴建武 中国科学院遗传与发育生物学研究所 起止年限： 2011.1至2015.8 依托部门： 中国科学院 一、研究内容 本项目的主要研究内容如下： （一）干细胞三维培养体系的建立 1）干细胞培养三维支架材料的制备 分离纯化胶原蛋白，制备三维支架材料，使其具有良好的生物相容性、适宜的硬度和孔隙结构，制备适合干细胞培养的三维胶原支架材料。细胞外基质成份胶原蛋白本身为机体内细胞所处三维环境中的固有成份，其具有良好的细胞相容性，可最大限度地在体外模拟体内干细胞生活的环境。 2）三维胶原支架材料的修饰、优化 在胶原支架材料的基础上，考虑多方因子和因素，将微环境中调控干细胞自我更新和定向分化的其它细胞外基质成份、信号分子或支持细胞等因素整合到胶原支架材料上，对三维胶原支架材料进行修饰优化，以最大限度的模拟体内干细胞自我更新和定向分化的环境。 3）干细胞三维培养体系的建立 将干细胞接种于三维支架材料上，检测并比较二维和三维培养的干细胞的自我更新、代谢、形态学及亚细胞结构的变化，包括用免疫染色及活细胞成像技术等观察细胞粘附特性及细胞骨架结构、细胞迁移和运动特性等。干细胞选择多潜能干细胞（ES细胞和iPS细胞）和成体干细胞（神经干细胞、心肌干细胞、骨骼肌干细胞）。 （二）三维培养干细胞的发育潜能与自我更新调控网络研究 1）ES细胞是最为人们熟知的多能性细胞，iPS细胞具有ES细胞相似的多能性。我们2）在建立在建立胚胎干细胞三维培养体系的基础上，探索三维培养胚胎干细胞的发育潜能，利用嵌合以及四倍体补偿等方法鉴定三维培养胚胎干细胞体内发育潜能及细胞多能性，并与二维培养体系下干细胞的发育潜能相比较。 2）细胞多能性的维持受到内源的转录因子Oct4和Nanog等调控网络的控制，外源信号和内源的转录因子之间协同作用共同维持ES细胞的不分化状态。我们拟在建立ES细胞和iPS细胞三维培养体系基础上，研究调控细胞多能性的这些因子之间的调控网络，解析其如何相互协同共同控制多能性细胞的不分化状态。并与二维培养体系下干细胞的自我更新调控网络相比较。 （三）三维培养干细胞的定向分化调控网络研究 研究将以向神经、心肌、骨骼肌的分化研究为主，主要内容如下： 1）检测并比较二维和三维培养的神经、心肌、成肌干细胞分化过程中的细胞学属性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达及细胞功能等。检测并比较干细胞定向分化过程中亚细胞结构水平的变化，用免疫染色及活细胞成像技术等观测细胞粘附特性及细胞骨架结构、细胞迁移和运动特性等。 2）运用生化方法检测并比较二维和三维培养的干细胞在分化过程中受外界信号因子诱导产生的细胞内信号通路的动态变化，分析它们各自信号转导途径整合的特性。其中神经细胞研究将以Erk及mTOR信号通路为主。心肌细胞研究利用已建立的人胚胎干细胞向心肌分化的体外培养模型，在三维培养条件下利用基因芯片或深度测序的方法取得基因表达谱，进行生物信息学分析，构建三维条件下心肌分化的转录因子网络。骨骼肌细胞的研究将以PI3K/AKT/GSK3β信号通路为主。 （四）三维培养干细胞自我更新与定向分化的表观遗传调控网络研究 1）外界的诱导物如生长因子或其它一些小分子可以和细胞表面的受体结合并在细胞内引起级联放大的信号转导反应。这些级联放大的信号可以控制或调节一系列参与细胞生长、增殖和分化的细胞内反应，如基因表达的上调或下调以及蛋白质的合成，修饰和降解。蛋白质激酶是介导细胞外刺激引起的细胞内信号转导级联反应的最重要的分子，干细胞的自我更新是受磷酸化蛋白严密调控的。我们将系统而定量地分析在二维和三维培养条件下多潜能细胞与成体干细胞自我更新和定向分化过程中蛋白质组和磷酸蛋白质组的差异，从而找出在三维培养条件下控制干细胞自我更新与定向分化的特异性的调控网络。 2）microRNA作为表观遗传调控的重要手段在干细胞自我更新和定向分化调控过程中发挥着重要作用。我们将用microRNA芯片进行高通量筛选，利用生物信息学方法，比较二维和三维培养的条件下多潜能细胞与成体干细胞的非编码RNA的表达差异，发现共同及特异表达的非编码RNA；对这些非编码RNA基因的基因组位置、结构等基因组特征进行分析并利用实验生物学方法探讨其转录调控机制。 （五）干细胞体内维持分化与功能研究 1）线虫内源神经干细胞维持与分化的关键因子 神经干细胞在体内受到niche微环境内多种因子、信号通路的调控。我们将首先建立线虫神经干细胞体内观察体系，进行全基因组RNAi筛选和化学诱变。然后通过内源启动子融合荧光实验，探明相应调控因子的组织表达谱。运用细胞自主性拯救实验探明该调控因子信号是如何调控内源神经干细胞的维持与分化。 2）同源干细胞分化调控因子在哺乳动物干细胞分化中的作用 研究哺乳动物中相对应的同源干细胞分化调控因子，利用RNAi和基因敲除技术研究这些调控因子如何影响二维和三维培养干细胞的维持与分化。 3）三维培养神经干细胞在小鼠纹状体区的维持、分化与神经回路的重建 三维培养神经干细胞将具有更好的自我更新潜能和分化潜能。我们将使用近红外量子点和磁性纳米颗粒对三维培养的神经干细胞在体外进行标记。经纳米材料示踪标记的神经干细胞将通过立体定位的方法直接注入到包裹小鼠纹状体的脑室侧壁，即神经干细胞的niche区。在细胞导入后不同时间分别使用增殖细胞、神经前体细胞、分化细胞、成熟神经元、神经突触等特异的分子标记，系统地检测外源神经干细胞在体内的增殖、分化行为以及功能回路的建立。同时使用核磁共振活体成像技术，对干细胞移植动物后进行三维、非破坏性纳米技术示踪以分析外源神经干细胞在体内的自我更新、定位、迁移、分化等。 4）外源神经干细胞参与神经功能的恢复 外源神经干细胞在体内的分化是否可以产生有功能的神经元，并参与神经功能的恢复？我们将使用神经退行性疾病模型小鼠—舞蹈病模型小鼠作为外源神经干细胞的受体，这样干细胞移植后通过检测舞蹈病模型小鼠的运动协调能力可以直接从功能上评估外源干细胞参与神经组织修复的能力。我们将使用Rotarod、Beam-balance、Gait analyis等方法评估外源神经干细胞参与神经功能的恢复能力。 （六）干细胞的纳米示踪与成像技术 1）高量子效率、高生物相容性量子点的制备 （1） 高量子效率、高生物相容性量子点的制备：在我们已有工作的基础上，进一步改进量子点合成技术，开发高量子效率的、荧光范围从可见光区到近红外光区的量子点，并提高量子点的生物相容性，满足三维培养的干细胞和活体干细胞标记和成像。 （2） 高生物相容性和高弛豫率磁性纳米颗粒的制备：通过控制纳米粒子的粒径、化学成分以及表面性质使其具有良好的弛豫性能和生物相容性。 2）三维培养干细胞的特异性标记：与课题1和2进行合作，针对三维培养的干细胞及其亚细胞结构，分别用相应的识别分子（如抗体、适配体、信号肽等）对量子点进行特异性修饰，对细胞骨架组分、细胞因子（如Wnt、FGF、BMP、Notch和TGF-β等）及相关受体、细胞内信号通路中蛋白质磷酸化相关蛋白、非编码RNA进行特异性标记。 3）活体干细胞的特异性标记：用近红外量子点或磁性纳米粒子对三维培养的干细胞在体外进行标记，采用立体定位注射的方法导入小鼠体内，利用近红外量子点的荧光信号或磁性纳米粒子的核磁信号对活体内的干细胞进行定位与跟踪，为研究其在体内生理环境下的增殖与分化机制提供证据。 4）三维培养干细胞的近红外荧光成像技术：利用单分子/单量子点荧光共定位技术，研究修饰后的近红外量子点对细胞骨架组分、细胞因子等的特异性标记性能。针对红外量子点的激发与发射光谱特性，研究适合近红外成像的激光共聚焦显微技术；研究近红外量子点在三维培养干细胞中的示踪技术，发展基于荧光成像的二维、三维培养干细胞分化过程定量分析手段。 5）活体干细胞的三维、非损伤性示踪技术：研究近红外光在活体干细胞中的散射与吸收性质，开发利用近红外量子点标记的活体动物荧光成像系统；并且利用活体动物荧光成像系统，对移植体内的近红外量子点标记的干细胞进行三维示踪；结合纳米磁性粒子造影技术，通过核磁共振成像对磁性纳米粒子标记的干细胞在活体内的维持和分化进行成像示踪。 二、预期目标 本项目的总体目标： 通过本项目的实施，建立干细胞三维培养和完善干细胞纳米示踪技术，解析干细胞自我更新与分化过程中遗传与表观遗传的调控网络，为干细胞的应用奠定基础。取得一批具有重大影响的科研成果，提高我国在干细胞研究领域的自主创新能力。 五年预期目标: 1．综合考虑多种因素，最大限度模拟体内环境，制备出适合干细胞生长分化的三维支架材料，建立三维培养多能干细胞和成体干细胞的自我更新和定向分化的研究体系。包括标准干细胞系的鉴定、维持、分析方法、保存与复苏、人员培训等基础设施和科研能力，建立三维培养4-6种不同干细胞的方法。建立一个全国公用的干细胞三维培养研究的培训基地。 2. 结合基因组、蛋白质组和磷酸蛋白质组分析结果探讨三维培养条件下干细胞自我更新和定向分化的分子和细胞机制，阐明在干细胞自我更新和定向分化中起关键调控作用的信号通路和信号网络、转录调控以及表观遗传调控网络。 3．通过模式动物体内干细胞维持与定向分化研究，发现并鉴定与神经干细胞的维持、分化相关的一些新基因，阐明其作用机制。明确体外三维培养的神经干细胞在体内的自我更新能力与分化潜能，并对其导入体内后的有效性、安全性进行评估。分析三维培养干细胞与体内干细胞维持与分化机制的异同，获得干细胞调控的真实信息。 4. 建立干细胞纳米示踪与成像新技术，包括制备出高生物相容性、高量子产率的量子点，建立量子点标记活细胞及亚细胞组分的方法，实现对三维培养干细胞以及活体干细胞的特异性标记，建立三维培养干细胞和活体干细胞的三维、非损伤性的纳米示踪与成像技术。 5．培养研究生30名。博士后10名。 6．在本领域发表论文30篇，其中影响因子5以上的15篇。 三、研究方案 1）学术思路： 干细胞的自我更新和定向分化是干细胞研究中的基本问题。在体内，干细胞的自我更新和分化是处于三维环境中，体外三维培养体系下细胞的行为学特性近似于体内细胞的特性。本项目将建立模拟体内环境的干细胞三维培养体系，并利用干细胞纳米标记与成像技术，研究三维培养干细胞自我更新和定向分化的调控网络。在体内研究中，以线虫和小鼠为模式动物，系统研究体内干细胞的维持、分化调控机制。 2）技术途径： 根据研究内容，本项目技术途径如图所示： 具体内容如下： 1） 适合不同类型干细胞培养的三维胶原支架的构建 分离纯化胶原蛋白，制备三维胶原支架材料，检测其生物相容性，运用不同生产工艺使其具有适宜的硬度和孔隙结构，建立适合不同类型干细胞培养的三维支架材料。 2）三维胶原支架材料的修饰、优化 在胶原支架材料的基础上，将微环境中调控干细胞自我更新和定向分化的其它细胞外基质成份、信号分子或支持细胞等因素通过不同的方法整合到胶原支架材料上，对三维胶原支架材料进行修饰优化，以最大限度的模拟体内干细胞自我更新和定向分化的环境。 3）干细胞三维培养体系的建立 干细胞选择多潜能干细胞（ES细胞和iPS细胞）和成体干细胞（神经干细胞、心肌干细胞、骨骼肌干细胞）。 （1）用纳米量子点-荧光标记结合活细胞成像技术记录和追踪经干细胞诱导分化的神经细胞在三维培养介质中的粘附、生长、迁移和运动等动态行为。在亚细胞水平用活体成像技术观测参与调控细胞行为的细胞骨架(如actin或 tubulin的荧光融合蛋白)及其他因子的动态变化。 （2）将不同干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，与二维培养体系相比较，利用芯片技术对二者基因表达情况进行比较，分析在三维培养条件下干细胞的基因表达情况，利用western blot等技术对关键因子的蛋白表达进行定量分析。综合利用细胞生物学和分子生物学的方法对两种培养体系下细胞的干细胞特性进行比较。 4）干细胞自我更新调控机制研究 （1）将干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，进行自我更新和定向分化研究。分离提取细胞RNA用Q-PCR检测干细胞及分化细胞标志蛋白以及调节干细胞定向分化的关键转录因子的表达，分离提取细胞总蛋白检测干细胞及分化细胞标志蛋白表达水平。用针对integrin等细胞表面标记以及细胞骨架蛋白的特异性抗体，通过免疫荧光染色比较二维和三维环境中干细胞及其定向分化细胞的细胞形态、粘附特性及运动特性。 （2）三维培养干细胞的发育潜能研究，在建立胚胎干细胞三维培养体系的基础上，探索三维培养胚胎干细胞的发育潜能，体外研究中重点探索三维胚胎干细胞向神经、心肌等细胞分化的能力及其调控机制，体内利用嵌合以及四倍体补偿等方法鉴定三维培养的胚胎干细胞体内发育潜能及细胞多能性。 （3）以生物化学方法检测三维培养环境中干细胞的自我更新和分化受外界信号调控的各种信号转导通路的动态变化，并与通过细胞生物学手段检测信号通路中各组分激活状态的亚细胞分布相结合，检测其下游靶基因的表达水平，以分析细胞中各种信号通路的整合情况，解析干细胞对于不同培养条件作出反应的分子基础。其中自我更新研究将以ES细胞和iPS细胞为主，探讨其以Oct4和Nanog为中心的干细胞自我更新的调控网络；。 5）干细胞定向分化调控机制研究 （1）选择成体干细胞包括神经、心肌和成肌干细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达及细胞功能等。 将干细胞接种于适宜的三维胶原支架材料，进行定向分化研究。通过细胞形态观察及免疫荧光染色检测干细胞定向诱导分化后产生的细胞类型（针对神经干细胞分化产生的细胞类型将分别用神经元、星形胶质细胞及寡树突细胞标志蛋白的特异抗体（神经元TuJ1及MAP2，星形胶质细胞GFAP，寡树突细胞OSP）作免疫荧光染色, 针对人胚胎干细胞分化产生的心肌细胞类型将分别用α-肌浆球蛋白重链（α-MHC）、肌钙蛋白C、心房利钠肽（ANP）等标志蛋白的特异抗体作免疫荧光染色,骨骼肌标志蛋白MHC和Caveolin-3）。例如肌原代成肌细胞或肌源性细胞系C2C12细胞在增殖阶段的培养条件为含10%胎牛血清的DMEM培养基，诱导分化的培养条件为含2%马血清的DMEM培养基，一般5～6天细胞可以分化成肌管。针对成肌干细胞分化产生的骨骼肌细胞将分别用骨骼肌标志蛋白MHC和Caveolin-3作免疫荧光染色。分离提取细胞RNA用Q-PCR检测干细胞及分化细胞标志蛋白以及调节干细胞分化的关键转录因子的表达，分离提取细胞总蛋白检测干细胞及分化细胞标志蛋白表达水平。检测并比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞在分化过程中亚细胞结构水平的变化，用针对integrin等细胞表面标记以及细胞骨架蛋白的特异性抗体，通过免疫荧光染色比较二维和三维环境中干细胞及其定向分化细胞的细胞形态、粘附特性及运动特性。通过与课题组四合作，用纳米量子点-荧光标记结合活细胞成像技术记录和追踪经干细胞诱导分化的神经细胞在三维培养介质中的粘附、生长、迁移和运动等动态行为。在亚细胞水平用活体成像技术观测参与调控细胞行为的细胞骨架(如actin或tubulin的荧光融合蛋白)及其他因子的动态变化。 （2）运用生化方法检测并比较二维和三维培养的干细胞分化过程中受外界信号因子诱导产生的细胞内信号通路的动态变化，并与通过细胞生物学手段检测信号通路中各组分激活状态的亚细胞分布相结合，并检测其下游靶基因的表达水平，分析它们各自信号转导途径整合的特性，解析干细胞对于不同培养条件作出反应的分子基础。其中神经细胞的研究将以Erk及mTOR信号通路为主，肌细胞的研究将以PI3K/AKT/GSK3β信号通路为主。 此外，我们已发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 通过STAT3-p63- Jagged-Notch 级联调控细胞维持细胞增殖和分化之间的平衡。功能低下或高度活化的mTOR信号通过影响Notch信号抑制细胞分化。因此计划探讨三维培养条件下干细胞定向分化的分子和细胞机制，阐明在干细胞定向分化中mTOR信号传导通路是否起关键调控作用。研究方案如下： 分离选择小鼠条件性 mTOR、 PTEN或Tsc1基因敲除 (mTOR活化) 的成体干细胞包括神经和成肌干细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，然后将TAT-NLS-Cre融合蛋白质加入细胞培养液，融合蛋白质将会被细胞摄取、入核，敲除mTOR基因或Tsc1基因，从而下调或上调mTOR通路的活性，然后检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达及细胞功能等。还可让这些小鼠与组织特异性 CRE 表达小鼠交配，在小鼠体内敲除mTOR、 PTEN或Tsc1，以明确mTOR在干细胞的定向分化中的作用。 小鼠条件性敲除胚胎干细胞 (loxp-mTOR-loxp) 已从欧洲条件性基因敲除小鼠项目（European Conditional Mouse Mutagenesis program）得到，将培育loxp-mTOR-loxp转基因小鼠，为条件性敲除mTOR小鼠做准备。已有条件性Pten或Tsc1基因敲除小鼠和神经、肌肉CRE表达小鼠。 （3）鉴定人胚胎干细胞向心肌前体细胞分化过程中起关键作用的转录因子网络和关键调节通路 表达KDR的细胞是心肌细胞的前提细胞。利用我们现有的心肌分化培养体系，将人胚胎干细胞在三维条件下分化成心肌细胞，并在相应的时间点，利用流式细胞分离仪分离取得KDR表达的心肌前体细胞和非表达细胞，然后再利用microarray 或深度测序技术获取这二类细胞的基因表达数据，并通过二者之间和与为分化的胚胎干细胞表达谱对比，找到在这一分化过程中上调和下调的前500个基因，并通过UCSC mm8得到这些基因的启动子序列，最后利用CREAD package 的Motifclass来发现出现在这些启动子中的具有代表性的（按出现频率划分）转录因子DNA结合位点。通过这些转录因子DNA结合位点来找到调节这一细胞分化过程的转录因子网络。最后，利用可诱导的基因表达系统在胚胎干细胞中验证这些转录因子在心肌分化中的功能。 |
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6）三维培养干细胞自我更新和定向分化的表观调控网络研究 （1）系统定量地分析在二维和三维培养条件下未分化干细胞和经诱导分化细胞之间的总蛋白质组和重要的蛋白质修饰（包括磷酸化、乙酰化和泛素化）的差异，从而找出在三维培养条件下控制干细胞自我更新与定向分化的特异性的调控网络。研究方案包括下图所示七个步骤： ①从三维和二维培养条件下未分化的干细胞和经诱导分化的细胞制备蛋白质样品。这样一共有四个样品，分别标记为三维未分化， 三维分化，二维分化，二维未分化。 ②从每个样品中分出等量的蛋白样品进行胰蛋白酶（Trypsin) 酶解，产生多肽混合物。 ③利用商业化的iTraq试剂，分别标记以上四个不同的样品。iTraq试剂有四个不同的标记物。这四个标记物在MS/MS图谱上所显示的峰其质量/电荷比分别为113，114，115，116。如果某一个多肽在四个样品中都存在，那么这个多肽就会被这四个标记物分别标记上。将这四个标记过的样品等量混合并进行LC-MS/MS分析，根据这四个标记物在MS/MS图谱上特异峰的信号强度，我们就可以对这个多肽在四个样品中的相对含量进行定量。 4对于总蛋白质组的分析，我们从每个标记的样品中取等量的样品加以混合。让后利用多维的液相层析和质谱联用的技术（LC-MS/MS), 同时对四个样品中的蛋白进行鉴定和定量。 ⑤对于磷酸蛋白质组的分析，我们从第三步标记好的四个样品中分别拿出等量样品并合并，然后先后用固定化金属离子亲和层析法(IMAC)和二氧化钛(TiO2)亲和层析法富集不同的磷酸肽亚群 (Bodenmiller et al., 2007)，并将收集到的磷酸肽合并到一起。同样，对与乙酰化和泛素化，我们将分别利用已发表的免疫沉降法和亲和层析法对被修饰的多肽进行富集。 ⑥利用多维LC-MS/MS进行蛋白质修饰位点的鉴定和定量。我们将利用最先进的带有ETD功能的LTQ-Orbitrap-Velos质谱仪来分析这些样品。这个质谱仪是目前世界上进行大规模蛋白质组研究的最好的仪器，具有高灵敏度，高分辨率，以及高精确度的特点。同时，附加的ETD（Electron Transfer Dissociation）功能是专门用来分析蛋白质修饰的。我们可以利用ETD方法和传统的CID(Collision Induced Dissociation)方法来进行蛋白质修饰位点的分析，以求获得更高的位点鉴定覆盖率。 ⑦利用生物信息学和计算生物学的方法对产生的蛋白质组和蛋白质修饰数据进行信号通路和网络的分析，找出与干细胞自我更新或定向分化相关的调控通路或网络。同时，我们将会找出一些与干细胞更新与定向分化特异相关的蛋白和修饰位点，进行进一步的功能研究。 （2）利用microRNA芯片进行高通量筛选。确定microRNA在三维干细胞自我更新和定向分化过程中的调控网络，具体途径如下： ①非编码RNA序列的筛选和生物信息学分析 获得二维和三维培养状态下的干细胞，提取细胞RNA，利用microRNA芯片进行高通量筛选。通过生物信息学分析，对非编码RNA进行功能分类、确认可能的新类别非编码RNA；分析非编码RNA的基因组定位、寻找可能的非编码RNA特异的上游调控元件。 ②报告基因系统确定非编码RNA基因的转录调控元件和转录调控因子 通过生物信息学方法分析非编码RNA基因的上游调控元件，进一步分析其中可能的转录调控因子结合位点，针对不同的转录调控因子结合位点构建缺失或点突变的报告基因（Luciferase）重组质粒，确定影响非编码RNA基因表达的转录调控因子及结合序列。 ③非编码RNA对干细胞自我更新、分化的影响 分别构建正义和反义非编码RNA重组质粒，转染神经干细胞或肌肉干细胞，观察超表达或Knockdown特定非编码RNA对其生物学功能的影响。进一步采用Northern和Western方法检测细胞增殖分化相关的标志基因（proliferation or differentiation marker）的表达情况，分析非编码RNA的功能。 7）模式动物体内干细胞维持分化与功能研究 将从基因、蛋白质、细胞与组织以及活体动物水平研究体内干细胞自我更新与分化。具体途径如下： （1）基因水平的研究：全基因组RNAi筛选和化学诱变，基因定位、克隆找到细胞分化调控因子。 （2）蛋白质水平的研究：利用双向电泳、质谱、显微注射、酵母双杂交和免疫共沉淀等技术研究蛋白质功能及蛋白质间的相互作用。 （3）细胞与组织水平的研究：利用建立的各种细胞和组织培养模型和流式细胞分离、激光共聚焦成像、显微注射、RNA干扰和过表达等技术，深入研究基因/蛋白质的功能及调控网络。 （4）活体动物研究：利用转基因疾病动物模型、干细胞移植等技术研究体内神经干细胞的自我更新与定向分化。 8）干细胞的纳米示踪与成像技术研究 将以高量子效率、高生物相容性量子点的制备为基础，通过对量子点的特异性修饰，实现对干细胞的特异性标记，利用荧光成像技术和核磁共振成像手段，对三维培养的干细胞和活体干细胞进行三维示踪成像。 具体研究途径如下： （1）纳米粒子的制备研究： a. 高量子效率、高生物相容性量子点：对目前实验室已有的量子点合成技术进行改进，使量子点在光稳定性、化学稳定性、低毒性、荧光量子产率、荧光半峰全宽等各个参数上满足后续应用的需要。选取恰当的配体，对量子点表面进行功能化修饰，提高其生物相容性。 b. 采用高温分解铁前驱体的方法合成磁性纳米粒子，通过优化前驱体浓度、回流时间、加热速率等反应条件，借助晶种生长法来控制粒径的大小。选用合适的铁前驱体和过渡金属前驱体进行热解，控制磁性纳米粒子的化学组成。通过表面配体置换对纳米粒子表面进行改性和修饰。 （2）量子点的特异性修饰：结合其它子课题的研究需求，利用特异性的识别分子对量子点、磁性颗粒通过共价或非共价的方式进行修饰，实现对细胞及其亚结构组分的特异性标记。 （3）活体干细胞的标记：将近红外量子点或磁性纳米粒子标记的干细胞在体外进行标记，然后导入小鼠体内，利用荧光信号或核磁信号对干细胞在小鼠体内的行为进行示踪。 （4）纳米示踪与成像： a. 通过量子点和生物分子标记对象的双色荧光共定位成像，可以在单分子水平研究近红外量子点对干细胞结构的特异性标记技术。 b. 采用共聚焦扫描技术实现干细胞三维成像与示踪。根据红外量子点的激发与发射波长的特点，选用合适波长的激光光源构建共聚焦荧光显微系统，可以有效降低本底信号强度，实现较高成像精度的三维红外荧光成像，满足对不同生长环境下干细胞的亚细胞结构对比研究。 c. 近红外光具有较大的组织穿透深度，利用近红外量子点构建活体荧光成像系统，可以在小动物尺度对干细胞的维持和分化进行示踪成像。 d. 直接将磁性纳米粒子标记的神经干细胞注射到包裹小鼠纹状体的脑室侧壁神经干细胞的niche区，将小鼠于不同时间点置入11.7T磁共振微成像仪中，分别采用自旋回波和梯度回波两种对铁敏感性不同的磁共振影像方法，设计优化脉冲系列，对小鼠脑部进行扫描，针对移植部位进行图像采集，研究外源性神经干细胞在体内的增殖、迁移、分化等。以磁共振影像技术作为核心技术，对比研究三维培养与二维培养干细胞在体内维持分化与功能的差异，支撑课题1、2、3的相关研究。 3) 创新点与特色： （1）三维培养体系中细胞的行为学特性更近似于体内细胞的环境。本项目模拟体内干细胞自我更新和定向分化的三维环境，建立干细胞的三维培养分化体系，在此基础上对干细胞自我更新和定向分化的调控网络进行研究。这是本项目重要创新点。 （2）活体细胞纳米示踪与成像技术作为生物医学研究的基本手段在干细胞的自我更新与分化的体内外研究中发挥着日益重要的作用。纳米标记与成像技术作为非损伤性的新型标记技术将获得传统二维细胞研究技术难以摄取的信息。 （3）系统定量地分析在二维和三维培养条件下干细胞自我更新和定向分化过程中蛋白质组和磷酸蛋白质组的差异，找出更接近体内环境中干细胞自我更新与分化的调控网络。 （4）本项目既有体外三维培养干细胞自我更新和分化的研究，又有模式动物体内干细胞自我更新和分化的研究，可以验证三维培养体系与体内环境的相似性。 4）可行性分析： （1）项目申请人主持了2006-2010年国家重大科学研究计划中“调控干细胞自我更新能力的分子网络研究”的项目，项目组对干细胞的自我更新和定向分化及其调控网络进行了较为深入的研究，取得了一些重要的研究结果，丰富和发展了以Oct4和Nanog等转录因子为核心的干细胞自我更新的调控网络。这些工作为进一步在三维培养条件下研究干细胞自我更新的调控机制奠定了基础。 （2）项目组成员在三维培养体系建立、干细胞定向分化研究、定量蛋白质组学、细胞迁移与粘附、纳米示踪与成像技术等研究以及模式动物实验体系建立等方面已有较好的积累（详见研究基础）。 （3）参加本项目的课题组来自中国科学院遗传与发育生物学研究所、中国科学院动物研究所、中国科学院生物物理所、中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所、中国医学科学院基础医学研究所、大连医科大学，课题组依托单位和重点实验室都具备先进的实验条件，为该项目的实施提供了充分必要的条件。 （4）本项目所设置的四个课题组的研究内容相互联系，研究成员之间已经建立了紧密的协作关系。 （5）项目申请人戴建武研究员是中国科学院“百人计划”入选者、国家杰出青年基金获得者、国家重大科学研究计划“调控干细胞自我更新能力的分子网络研究”（2006-2010）项目首席科学家，为本项目的运行积累了组织和协调经验。项目课题负责人均为相关研究领域的优秀学科带头人。学术骨干队伍由精力充沛的优秀青年科研人员组成。 5） 课题设置 本项目利用细胞示踪和成像技术，研究三维培养干细胞和体内干细胞自我更新与定向分化的调控机理。本项目设置四个课题： 课题1 干细胞三维培养与自我更新调控网络的研究 课题2 三维培养干细胞的定向分化调控网络研究 课题3 干细胞体内维持分化与功能研究 课题4 干细胞的纳米示踪与成像技术 四个课题相互独立又相互联系，其中课题4建立的纳米示踪与成像技术在课题1、课题2、课题3的研究过程中均会得到应用。课题1和课题2的研究为体外研究，其分别研究三维培养干细胞的自我更新和定向分化调控。自我更新和定向分化的调控机制既相互区别又相互联系。课题3为模式动物体内干细胞自我更新与定向分化研究，其体内的研究结果可与课题1、课题2体外干细胞自我更新和定向分化的研究结果相互验证。 课题1：干细胞三维培养与自我更新调控网络的研究 研究目标： 制备出适合干细胞生长分化的三维胶原支架材料；建立多潜能干细胞和成体干细胞的三维培养体系，阐释三维培养条件下胚胎干细胞的发育潜能与自我更新的分子机制；结合蛋白质组和磷酸蛋白质组以及microRNA分析结果探讨三维培养条件下干细胞自我更新表观调控机制，阐明在干细胞自我更新起关键调控作用的表观遗传网络。 研究内容： 1）适合不同类型干细胞培养的三维支架的构建 分离纯化胶原蛋白，制备不同类型的三维支架材料，使其具有良好的生物相容性，适宜的硬度和孔隙结构，建立适合不同类型干细胞培养的三维胶原支架材料。 2）三维胶原支架材料的修饰、优化 在胶原支架材料的基础上，将微环境中调控干细胞自我更新和分化的其它细胞外基质成份、信号分子或支持细胞等因素整合到胶原支架材料上，对三维胶原支架材料进行修饰优化，以最大限度的模拟体内干细胞自我更新和分化的环境。 3）干细胞三维培养体系的建立 干细胞选择多潜能干细胞ES细胞和iPS细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，检测并比较二维和三维培养的干细胞细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达能等。检测并比较二维和三维培养的干细胞在生长和分化过程中的亚细胞结构水平的变化。 4）三维培养胚胎干细胞发育潜能研究 在建立胚胎干细胞三维培养体系的基础上，探索三维培养胚胎干细胞的发育潜能。利用嵌合以及四倍体补偿等方法鉴定三维培养胚胎干细胞体内发育潜能及细胞多能性，并与二维培养体系下干细胞的发育潜能相比较。 5）三维培养干细胞的自我更新研究 建立ES细胞和iPS细胞三维培养体系基础上，研究调控细胞多能性的这些因子之间的调控网络，解析其如何相互协同共同控制多能性细胞的不分化状态。 6）三维培养干细胞自我更新的表观遗传调控网络 用基因组学及蛋白质组学方法检测并比较二维和三维培养的干细胞在在自我更新过程中的表观遗传学变化，包括蛋白质组和磷酸蛋白质组、非编码RNA表达谱等。 承担单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所 中国科学院动物研究所 大连医科大学 课题负责人：戴建武 学术骨干：汪迎春、刘蕾、丁文勇、林琳、田余祥 经费比例：34% 课题2：三维培养干细胞的定向分化调控网络研究 研究目标： 综合运用细胞生物学、生物化学、材料科学及系统生物学研究方法，检测三维培养中干细胞自我更新和分化状态的各项指标，以建立一套完善有效的干细胞三维培养的评价体系。结合蛋白质组和磷酸蛋白质组分析结果探讨三维培养条件下干细胞定向分化的分子和细胞机制，阐明在干细胞定向分化中起关键调控作用的信号通路和信号网络及表观遗传网络。 研究内容： 1）选择成体干细胞包括神经、心肌和成肌干细胞，将干细胞接种于三维支架材料上，检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化、标志蛋白表达及细胞功能等。检测并比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞在分化过程中亚细胞结构水平的变化，包括用免疫染色及活细胞成像技术等观测细胞粘附特性及细胞骨架结构、细胞迁移和运动特性等。 2）运用生化方法检测并比较二维和三维培养的干细胞分化过程中受外界信号因子诱导产生的细胞内信号通路的动态变化，分析它们各自信号转导途径整合的特性。 3）用基因组学及蛋白质组学方法检测并比较二维和三维培养的干细胞在生长和分化过程中的表观遗传学变化，包括蛋白质组和磷酸蛋白质组、microRNA表达谱等。 4）利用已建立的人胚胎干细胞向心肌分化的体外培养模型,在三维培养条件下利用基因芯片或深度测序的方法取得基因表达谱，进行生物信息学分析，构建三维条件下心肌分化的转录因子网络。 承担单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所 中国医学科学院基础医学研究所 中国科学院生物物理研究所 课题负责人：刘佳佳 学术骨干：马跃、张宏冰、张蕾、杨艳蕊 经费比例：31% 课题3：干细胞体内维持分化与功能研究 研究目标： 通过模式动物体内干细胞自我更新与分化研究，发现并鉴定与神经干细胞的维持、分化相关的一些新基因，阐明其作用机制。明确三维培养的神经干细胞在体内的自我更新能力与分化潜能，并对其导入体内后的有效性、安全性进行评估。分析三维培养干细胞与体内干细胞维持与分化机制的异同，获得干细胞调控的真实信息。 研究内容： 1）线虫内源神经干细胞维持与分化的关键因子 首先建立线虫神经干细胞体内观察体系，利用线虫容易进行大规模筛选的特性，进行全基因组RNAi筛选和化学诱变。然后通过内源启动子融合荧光实验，探明相应调控因子的组织表达谱。运用细胞自主性拯救实验探明该因子调控内源神经干细胞维持与分化的分子机制。 2）同源干细胞分化调控因子在哺乳动物干细胞分化中的作用 研究哺乳动物中相对应的同源干细胞分化调控因子，利用RNAi和基因敲除技术研究这些调控因子如何影响哺乳动物干细胞的维持与分化。 3） 三维培养神经干细胞在小鼠纹状体区的维持、分化与神经回路的重建 将使用近红外量子点和磁性纳米颗粒对三维培养的神经干细胞在体外进行标记。经纳米材料示踪标记的神经干细胞将通过立体定位的方法直接注入到包裹小鼠纹状体的脑室侧壁，即神经干细胞的niche区。在细胞导入后不同时间分别使用增殖细胞、神经前体细胞、分化细胞、成熟神经元、神经突触等特异的分子标记，系统地检测外源神经干细胞在体内的维持、分化行为以及功能回路的建立。同时使用核磁共振活体成像技术，对干细胞移植动物后进行三维、非破坏性纳米技术示踪以分析外源神经干细胞在体内的增殖、定位、迁移、分化等。 4) 外源神经干细胞参与神经功能的恢复 使用神经退行性疾病模型小鼠—舞蹈病模型小鼠作为外源神经干细胞的受体。干细胞移植后通过检测舞蹈病模型小鼠的运动协调能力可以直接从功能上评估外源干细胞参与神经组织修复的能力。 承担单位：中国科学院动物研究所 中国科学院遗传与发育生物学研究所 课题负责人：唐铁山 学术骨干：丁梅、关丽英、 李夏 、陈倩 经费比例：18% |
2楼2010-08-15 22:03:02
purpleboy623
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续2
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课题4：干细胞的纳米示踪与成像技术 研究目标： 建立干细胞纳米示踪与成像新技术，包括制备出高生物相容性、高量子产率的量子点，建立量子点标记活细胞及亚细胞组分的方法，实现对三维培养干细胞以及活体干细胞的特异性标记，建立三维培养干细胞和活体干细胞的三维、非损伤性的纳米示踪与成像技术。 研究内容： 1）高量子效率、高生物相容性量子点的制备 （1） 高量子效率、高生物相容性量子点的制备：在我们已有工作的基础上，进一步改进量子点合成技术，开发高量子效率的、荧光范围从可见光区到近红外光区的量子点，并提高量子点的生物相容性，满足三维培养的干细胞和活体干细胞标记和成像。 （2） 高生物相容性和高弛豫率磁性纳米颗粒的制备：通过控制纳米粒的粒径、化学成分以及表面性质使其具有良好的弛豫性能和生物相容性。 2）三维培养干细胞的特异性标记：与课题1和2进行合作，针对三维培养的干细胞及其亚细胞结构，分别用相应的识别分子（如抗体、适配体、信号肽等）对量子点进行特异性修饰，对细胞骨架组分、细胞因子（如Wnt、FGF、BMP、Notch和TGF-β等）及相关受体、细胞内信号通路中蛋白质磷酸化相关蛋白、非编码RNA进行特异性标记。 3）活体干细胞的特异性标记：用近红外量子点或磁性纳米粒子对三维培养的干细胞在体外进行标记，采用立体定位注射的方法导入小鼠体内，利用近红外量子点的荧光信号或磁性纳米粒子的核磁信号对活体内的干细胞进行定位与跟踪，为研究其在体内生理环境下的增殖与分化机制提供证据。 4）三维培养干细胞的近红外荧光成像技术：利用单分子/单量子点荧光共定位技术，研究修饰后的近红外量子点对细胞骨架组分、细胞因子等的特异性标记性能。针对红外量子点的激发与发射光谱特性，研究适合近红外成像的激光共聚焦显微技术；研究近红外量子点在三维培养干细胞中的示踪技术，发展基于荧光成像的二维、三维培养干细胞分化过程定量分析手段。 5）活体干细胞的三维、非损伤性示踪技术：研究近红外光在活体干细胞中的散射与吸收性质，开发利用近红外量子点标记的活体动物荧光成像系统；并且利用活体动物荧光成像系统，对移植体内的近红外量子点标记的干细胞进行三维示踪；结合纳米磁性粒子造影技术，通过核磁共振成像对磁性纳米粒子标记的干细胞在活体内的维持和分化进行成像示踪。 承担单位：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 课题负责人：王强斌 学术骨干：邓宗武、吴东岷、李晓然 经费比例：17% 四、年度计划 年度 研究内容 预期目标 第 一 年 1． 构建适合不同类型干细胞培养的三维支架，建立干细胞三维培养体系。 2． 三维培养体系下干细胞表型研究，并与二维培养体系相比较。 3． 建立三维培养条件下干细胞定向分化的研究体系，检测比较二维和三维培养的神经、心肌和成肌干细胞分化过程中的细胞学特性，包括细胞形态变化及细胞功能等。 4． 用二维培养的细胞作为实验材料，建立稳定的蛋白质/磷酸化蛋白质分离、纯化、质谱学鉴定、以及生物信息学分析的实验和数据分析体系。 5． 模式动物干细胞体内观察体系和小鼠脑内立体定位细胞导入的方法研究。 6． 制备荧光光谱从可见光区到近红外区的量子点和超顺磁纳米颗粒，对其表面进行功能化修饰，对量子点荧光性能研究。 1． 选择适宜干细胞培养的三维培养材料，建立干细胞三维培养体系。 2． 获得三维培养干细胞形态、增殖情况、凋亡情况等细胞表型结果。 3． 初步建立三维培养条件下干细胞定向分化体系。 4． 建立成熟的能鉴定超过3000个干细胞总蛋白和1000个磷酸化位点的实验体系。 5． 获得多个稳定的转基因线虫株系，并完成系统跟踪神经干细胞及其分化子细胞在体内的生成、迁移以及分化过程；得到小鼠脑内细胞导入的立体定位参数。 6． 制备得到高质量的量子点和磁性粒子，并对其表面进行生物相容性修饰；完成单分子/单量子点荧光成像系统搭建。 发表论文3-5篇 第 二 年 1．三维胶原支架材料的修饰、优化 2．三维培养干细胞的自我更新相关基因的表达研究。 3．三维培养干细胞定向分化的研究 4．制备二维和三维培养条件下干细胞的蛋白质样品，并应用IMAC技术和免疫亲和层析技术纯化磷酸化蛋白，乙酰化蛋白、以及泛素化蛋白，并进行初步的质谱学分析。 5．获得二维和三维不同培养状态下的干细胞，提取细胞RNA，利用microRNA芯片进行高通量筛选。对筛选到的序列进行生物信息学分析。 6．检测以Wnt，Notch为代表的信号分子对神经干细胞体内维持及定向分化的影响。开展全基因组RNAi筛选，确定与体内干细胞定向分化相关的潜在靶基因。 7．优化近红外量子点和磁性纳米颗粒对三维培养的神经干细胞在体外进行标记的条件， 并将经纳米材料示踪标记的神经干细胞将通过立体定位的方法直接导入到包裹小鼠纹状体的脑室侧壁，即神经干细胞的niche区。 8．利用特异性的识别分子对量子点进行修饰，制备特异性修饰量子点，通过单分子/单量子点荧光共定位技术研究量子点对细胞及其亚结构组分的特异性标记，并进行体外干细胞诱导分化及标记；优化磁共振影像技术中磁共振影像脉冲序列、空间分辨率和以细胞数量为基准的信号灵敏度等系统指标。 1．初步获得二维、三维培养干细胞自我更新和定向分化相关基因表达差异。 2．制备能够进行5次重复实验的二维和三维干细胞总蛋白样品。其中每个总蛋白样品不少于1毫克，每个蛋白质修饰的样品不少于500微克。 3．确定二维和三维培养的干细胞在生长和分化过程中microRNA的时空表达谱。系统发现和鉴定一批二维和三维培养条件下未分化干细胞和经诱导分化细胞中有表达差异的microRNA。 4． 探明以Wnt，Notch为代表的信号分子在神经干细胞体内维持及定向分化中的作用， 确定几个与体内神经干细胞定向分化相关的靶基因。 5． 完成三位培养神经干细胞体外纳米材料标记的适宜条件和干细胞脑内导入。 6．实现量子点对细胞及其亚结构的特异性标记，实现单分子水平双色荧光共定位测量，定位精度<20nm；完成对磁共振影像技术的各种优化指标。 发表论文5-8篇 第 三 年 1．三维培养干细胞发育潜能鉴定。 2．三维培养干细胞自我更新的调控网络研究。 3．三维培养干细胞定向分化的调控网络研究。 4．大规模的定量蛋白质组学分析。系统地鉴定并比较二维和三维培养条件下细胞内蛋白质表达和翻译后修饰的差异。 5．microRNA基因结构和表达调控研究：microRNA基因结构分析，包括启动子、转录起始位点、可能的内含子等；重点分析独立转录的microRNA基因的上游调控元件；用报告基因系统研究microRNA基因的启动子和转录调控因子。 6．对RNAi筛选获得的靶基因进行初步表达图谱分析，解析其在神经干细胞定向分化中可能的细胞自主或非自主性行为，并获得相应突变体，进一步分析该靶基因功能，开展以EMS为主的化学诱变，分离神经干细胞定向分化有缺陷的突变株系。 7．小鼠体内纳米示踪标记，系统地检测外源神经干细胞在体内的维持、分化行为。同时使用核磁共振活体成像技术，分析外源神经干细胞在体内的增殖、定位、迁移、分化等。 8．将近红外量子点或磁性纳米粒子标记的干细胞在体外进行标记，研究适合近红外成像的激光共聚焦显微技术，然后利用荧光信号进行二维培养干细胞在老鼠体内行为示踪，实现活体干细胞的标记；利用磁共振影像示踪技术系统研究二维培养干细胞移植小鼠脑部后的维持分化过程及其功能。 1．获得二维、三维培养胚胎干细胞发育潜能差异结果。 2．确定二维、三维培养干细胞调控网络差异。 3．明确mTOR信号通路在干细胞定向分化中的作用 4．确定新发现的microRNA的基因结构；确定一些microRNA的启动子元件和转录调控因子。 5．揭示某些细胞因子、小分子化合物在人类心肌分化上的作用机制。 6．通过5次重复实验， 定量鉴定出超过3000/1000个二维和三维培养干细胞的总蛋白/磷酸化位点，以及不少于50个乙酰化和泛素化位点。 7．进一步确认与神经干细胞维持分化有关的几个靶基因的功能，并分离神经干细胞定向分化缺陷株系。 8．完成约60-80只小鼠的脑内神经干细胞导入，系统地分析外源神经干细胞在小鼠脑内的定位、迁移、维持与分化。 9．实现二维培养干细胞的近红外量子点标记三维荧光成像技术和磁性纳米粒子的活体磁共振成像。 发表论文5-8篇 第 四 年 1．三维培养干细胞自我更新和定向分化的调控网络进一步研究。 2． 生物信息学分析，找出三维培养条件下干细胞自我更新和定向分化的调控网络，并用生物化学和分子生物学的手段对蛋白质组学和生物信息学的研究结果进行独立验证。 3． microRNA在干细胞自我更新和定向分化中的功能研究和靶基因的鉴定。利用多种蛋白标记，深入分析化学诱变获得的突变体其表型产生的根源，开展基因克隆，表达谱建立等工作，结合遗传互作，蛋白质互作，找到哺乳动物中相对的同源蛋白，通过RNAi等基因敲除手段研究其在三维培养干细胞中调控干细胞维持和分化的作用。 4． 将三位培养神经干细胞将通过立体定位的方法移植到舞蹈病模型小鼠脑内，功能上评估外源干细胞参与神经组织修复的能力。 5． 利用活体荧光成像手段或者核磁共振成像技术对三维培养的干细胞和活体干细胞进行示踪。建立基于荧光成像的三维培养干细胞分化过程的定量分析手段；利用磁共振影像示踪技术系统研究三维培养干细胞移植体内后的维持分化过程及其功能，在单纳米粒子水平研究干细胞结构的特异性标记技术，实现纳米示踪与成像。 1． 争取确定15-20个重要的磷酸化位点，找出调控三维培养干细胞自我更新信号调控网络的关键分子。 2. 阐明在干细胞定向分化中mTOR信号传导通路是否起关键调控作用。 3. 筛选多个影响干增殖分化的microRNA；鉴定多个microRNA调控的靶基因并进行相关功能研究。 4. 揭示某些细胞因子、小分子化合物在人类心肌分化上的作用机制。 5．通过系统地研究与神经干细胞维持分化有关的几个靶基因，确定靶基因间的相互调控关系以及在哺乳动物三位培养干细胞中的作用 6．完成约60只舞蹈病模型小鼠的脑内神经干细胞导入，系统地从功能上分析外源神经干细胞参与神经退行性疾病模型小鼠脑内神经组织的修复。 7．实现三维培养干细胞的近红外量子点标记三维荧光成像技术和磁性纳米粒子的活体磁共振成像。 发表论文5-10篇。 第 五 年 1．确定调控三维培养干细胞自我更新和定向分化信号调控网络的关键分子的基础上，对其上下游的调控因子及调控机制进行深入研究。 2．进一步确定神经干细胞体内维持、定向分化调控网络。进一步从病理学上分析外源神经干细胞移植后的维持与分化。 3．预备结题。 1．建立干细胞三维培养体系和干细胞纳米示踪成像方法。 2．丰富和完善干细胞自我更新的调控网络，建立调控三维培养干细胞自我更新信号和定向分化的调控网络。 2．确定神经干细胞体内维持、定向分化相关的几个靶基因的调控网络；完成外源神经干细胞参与神经退行性疾病损伤组织修复的功能评估。 发表论文5-10篇。 |
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microscopyxmc
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