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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因克隆表达中信号肽的问题
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tzaixmc

木虫 (正式写手)

[求助] 基因克隆表达中信号肽的问题

我最近想在大肠杆菌BL21中表达其他细菌的蛋白，用pet系列的载体。我的目的基因自身带有一段信号肽序列，我的目的是检测这种蛋白具有目的活性就行（不管是分泌型的还是不分泌的）。我想问的是我要设计引物的时候要去掉信号肽的部分吗？我可不可以选不带有信号肽的pet载体，把目的基因自身的信号肽也一起克隆进去？如果克隆进去的信号肽不能被切除是否会影响蛋白的活性？
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1楼 2012-09-02 16:51:07
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lxj341401 at 2012-09-03 20:42:39
1、转录肯定是从T7 promoter那儿开始。
2、转录有终止，T7 terminator。
3、翻译是是从Nde Ⅰ那儿的ATG开始，在BamH Ⅰ和Xh Ⅰ之间插入，即使ATG也是从Nde Ⅰ那儿的ATG开始翻译。
4、在BamH Ⅰ和Xh Ⅰ之间插入一 ...

还有几点不明白：
1.如果我的插入片段不带TAA，那是在His-tag后面的TGA那儿终止还是T7 terminator的TAA那儿终止？
2.两种起始密码子GTG，ATG，三种终止密码子TAA，TAG，TGA密码子都能在pet载体中在BL21中被正确起始和终止吗？效率一样吗？
3.关于上面的第5个问题，我不想要信号肽也不想要任何标签。那我就是利用Nde Ⅰ中的ATG起始翻译紧接着是去掉信号肽的成熟肽并带上基因自身的TAA。那实际上最后我的蛋白是去掉信号肽的部分但是N端还是带了ATG翻译出来的甲硫氨酸吧？那有没有什么策略可以得到单纯的成熟肽（其他载体可以带标签翻译出来再切掉）？推介一下
非常感谢！！
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7楼2012-09-04 08:43:38
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
tzaixmc: 金币+5 2012-09-03 09:55:35
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-09-03 13:46:51
信号肽最好是去掉，因为带有信号肽表达不了，但是也有些个别例子就行。我以前就做过对照，去和没去的都做出来了，但是只有那么一个特例，其他的都不行。你是研究蛋白的活性，去掉信号肽后直接克隆到pet系列的载体上在BL21中表达，然后纯化就好，但是载体最好是不要带标签，要不然对你后期蛋白活性的研究有点麻烦，但带着也是没有问题的。
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生物化学与分子生物学
2楼2012-09-02 22:08:03
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tzaixmc

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-02 22:08:03
信号肽最好是去掉，因为带有信号肽表达不了，但是也有些个别例子就行。我以前就做过对照，去和没去的都做出来了，但是只有那么一个特例，其他的都不行。你是研究蛋白的活性，去掉信号肽后直接克隆到pet系列的载体上 ...

你的意思是说信号肽如果不切除的话可能会导致蛋白没有活性？那去掉信号肽的基因最好在pet多少的上面表达啊？是不是得用载体自身的ATG起始密码子？
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3楼2012-09-03 09:55:21
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 专家，好久没见了哦 2012-09-03 13:47:28
tzaixmc: 金币+5 2012-09-03 19:38:22
1、信号肽最好去掉，没有去掉的话很大的可能表达出来是没有活力的，因为宿主不能识别这个信号肽序列，不会把信号肽切割，表达出来的是带信号肽的蛋白，不是你要的成熟蛋白，对活性一般是有影响的。
2、不一定要选择带信号肽的质粒，你如果要让蛋白分泌的话可以选择pet20等，如果如果想融合表达的话pet32、39都可以，如果没有这些要求，pet28是个不错的选择。
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4楼2012-09-03 10:01:37
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