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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆目的基因
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆目的基因

一直在从一个全基因组不知道的菌种克隆目的基因，最近根据同源性设计了兼并引物。现在遇到了以下这些问题：
1.用兼并引物P目的片段时，使用梯度PCR做的，确定退火温度在58—65之间都有条带，最后回收胶，做连接，转化，蓝白斑筛选，挑了18个白斑进行菌落PCR，发现没有目标条带。（注：因为是新手，切胶回收时切得有些宽，师姐说可能回收率太低）
2.介于上次失败，所以就从头开始做一次克隆，所选的退火温度是62℃。但是这次居然没有P出来。只有一条很淡的条带，这也没法回收啊。
所以请高手指点一下啦。万分感谢。
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nothing isimpossible
1楼 2012-05-27 22:43:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by trizol11 at 2012-05-28 12:51:13
楼主，你的菌液PCR的反应条件可以给我不？谢谢

我做的是菌落PCR。
95℃      5min
95℃      1min   30个 循环
63℃      1min   30个循环
72℃       1min30s    30个循环
72℃      10min
4℃        ------
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nothing isimpossible
8楼2012-05-28 21:40:08
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普通回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan: 金币+1, ★有帮助 2012-05-28 21:36:03
菌落PCR有时P不出来...可以直接提质粒验证...
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2楼2012-05-28 00:45:26
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 21:56:52
只有一条很淡的条带，这也没法回收啊...这种情况可以再次PCR...直接P的足够量，现在各种pfu价格都不是很高,继续做...
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3楼2012-05-28 00:47:30
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maoyong

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 16:01:13
hraikeyan: 金币+1 2012-05-28 21:36:13
(1)菌落PCR只能做初步判断，最好是直接提质粒再检测；
(2)条带太弱的话，可以把退火温度调一下，或是做二次回收
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4楼2012-05-28 08:16:19
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yinchu1990

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌落PCR不好  最好提质粒验证
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5楼2012-05-28 09:01:00
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trizol11

木虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 应助指数-1, 这个不算应助哈 2012-05-28 21:57:14
楼主，你的菌液PCR的反应条件可以给我不？谢谢
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任重道远……
6楼2012-05-28 12:51:13
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jasonwyb123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-28 16:01:25
hraikeyan: 金币+2 2012-05-28 21:40:26
你这种情况很正常，需要多尝试一下
第一，你不一定就局限于62°，可以换一个，
第二，切胶时尽量少切没用的空白胶，我有个师兄号称是“刘三刀”，因为再难看的胶他三刀之内都切的不错，可以学习这个，反正尽量把胶切薄，切少
第三，聚落pcr效率有点差，你可以用1ml的管子小摇一下，37°估计2~3h就差不多了吧，具体忘记了，之后菌液p或者抽质粒再做
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7楼2012-05-28 14:34:54
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trizol11

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-05-28 21:40:08
我做的是菌落PCR。
95℃      5min
95℃      1min   30个 循环
63℃      1min   30个循环
72℃       1min30s    30个循环
72℃      10min
4℃        ------...

谢谢，战友
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任重道远……
9楼2012-05-29 12:10:53
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无踪无影

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-05-29 18:56:26
可以把PCR产物浓缩之后再跑电泳胶回收，十分之一醋酸钠，两点五倍酒精，混合1小时以上-20度，洗涤之后溶于水中，溶水的量自己定吧
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一切皆有可能
10楼2012-05-29 15:52:29
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