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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有人找公司合成过目的基因吗
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liyanying06

新虫 (初入文坛)

[交流] 有人找公司合成过目的基因吗 已有2人参与

我打算在目的基因上下游设计酶切位点，然后找公司合成。公司为我提供的是一份4ul的质粒和穿刺菌。如何将质粒上的目的基因克隆到我的表达载体上呢？
我有三个方案：
（1）将克隆载体和表达载体的混合体系一起进行双酶切；
（2)先将载体双酶切，然后电泳回收目的基因，再克隆到表达载体上。
（3）PCR扩增目的基因，双酶切克隆到表达载体上。
请问哪种方法比较好一点？
我刚开始做分子生物学，很多东西都不懂，希望有好心人帮助。在这里先谢谢大家啦。
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1楼 2011-05-14 12:07:34
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yabxxh

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+6, EPI+1): good 2011-05-14 15:27:16
...，你这个还是要补一下基础知识了，这个其实还是挺简单的。
首先，既然有穿刺菌，我觉得还是应该去摇个菌，提一下质粒，提完质粒之后做一个双酶切鉴定，然后再去测一个序（如果基因合成公司有附带测序报告的话，可以不用测序），因为基因合成行业是有一个允许的错误几率的，虽然很小，但是一旦发生那就是100%。
然后，鉴定都正确了，就可以做表达载体了，双酶切你的表达载体和含有你目的基因的质粒，回收纯化之后，用T4连接酶进行连接，转化之后进行表达载体的鉴定和测序。如果目的片段很大的话，还是要16度过夜连接比较稳妥，比价小的话就有很多连接试剂盒可以用了。
最后，鉴定正确的表达载体可以进入下一步试验。
好运。
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2楼2011-05-14 14:42:50
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
1949stone(金币+1): 补充到位 2011-05-15 19:48:11
楼上的说的很详细了，补充一点，目的基因两端有酶切位点就不要随便做PCR，PCR会造成突变的，直接酶切然后连接。
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3楼2011-05-14 15:02:47
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liyanying06

新虫 (初入文坛)
1949stone: 多多发帖 多交朋友 2011-05-15 19:48:41
引用回帖:
Originally posted by liyanying06 at 2011-05-14 12:07:34:
我打算在目的基因上下游设计酶切位点，然后找公司合成。公司为我提供的是一份4ul的质粒和穿刺菌。如何将质粒上的目的基因克隆到我的表达载体上呢？
我有三个方案：
（1）将克隆载体和表达载体的混合体系一起进行 ...

谢谢各位的回答，感激涕零！！！
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4楼2011-05-14 20:26:11
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