应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆目的基因
121/2返回列表12下一页
查看: 2297  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆目的基因

一直在从一个全基因组不知道的菌种克隆目的基因，最近根据同源性设计了兼并引物。现在遇到了以下这些问题：
1.用兼并引物P目的片段时，使用梯度PCR做的，确定退火温度在58—65之间都有条带，最后回收胶，做连接，转化，蓝白斑筛选，挑了18个白斑进行菌落PCR，发现没有目标条带。（注：因为是新手，切胶回收时切得有些宽，师姐说可能回收率太低）
2.介于上次失败，所以就从头开始做一次克隆，所选的退火温度是62℃。但是这次居然没有P出来。只有一条很淡的条带，这也没法回收啊。
所以请高手指点一下啦。万分感谢。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
nothing isimpossible
1楼 2012-05-27 22:43:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by trizol11 at 2012-05-28 12:51:13
楼主，你的菌液PCR的反应条件可以给我不？谢谢

我做的是菌落PCR。
95℃      5min
95℃      1min   30个 循环
63℃      1min   30个循环
72℃       1min30s    30个循环
72℃      10min
4℃        ------
赞一下(1人) 回复此楼
nothing isimpossible
8楼2012-05-28 21:40:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan: 金币+1, ★有帮助 2012-05-28 21:36:03
菌落PCR有时P不出来...可以直接提质粒验证...
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-28 00:45:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 21:56:52
只有一条很淡的条带，这也没法回收啊...这种情况可以再次PCR...直接P的足够量，现在各种pfu价格都不是很高,继续做...
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-28 00:47:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

maoyong

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 16:01:13
hraikeyan: 金币+1 2012-05-28 21:36:13
(1)菌落PCR只能做初步判断，最好是直接提质粒再检测；
(2)条带太弱的话，可以把退火温度调一下，或是做二次回收
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-28 08:16:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yinchu1990

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌落PCR不好  最好提质粒验证
赞一下 回复此楼
5楼2012-05-28 09:01:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

trizol11

木虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 应助指数-1, 这个不算应助哈 2012-05-28 21:57:14
楼主，你的菌液PCR的反应条件可以给我不？谢谢
赞一下 回复此楼
任重道远……
6楼2012-05-28 12:51:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jasonwyb123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-28 16:01:25
hraikeyan: 金币+2 2012-05-28 21:40:26
你这种情况很正常，需要多尝试一下
第一，你不一定就局限于62°，可以换一个，
第二，切胶时尽量少切没用的空白胶，我有个师兄号称是“刘三刀”，因为再难看的胶他三刀之内都切的不错，可以学习这个，反正尽量把胶切薄，切少
第三，聚落pcr效率有点差，你可以用1ml的管子小摇一下，37°估计2~3h就差不多了吧，具体忘记了，之后菌液p或者抽质粒再做
赞一下 回复此楼
7楼2012-05-28 14:34:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

trizol11

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hraikeyan at 2012-05-28 21:40:08
我做的是菌落PCR。
95℃      5min
95℃      1min   30个 循环
63℃      1min   30个循环
72℃       1min30s    30个循环
72℃      10min
4℃        ------...

谢谢，战友
回复此楼
任重道远……
9楼2012-05-29 12:10:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

无踪无影

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, Good！ 2012-05-29 18:56:26
可以把PCR产物浓缩之后再跑电泳胶回收，十分之一醋酸钠，两点五倍酒精，混合1小时以上-20度，洗涤之后溶于水中，溶水的量自己定吧
赞一下 回复此楼
一切皆有可能
10楼2012-05-29 15:52:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 hraikeyan 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 h4CP7TrQR8Lg 2026-08-22 5/250 2026-08-23 12:09 by LR9qGULyN2ew
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +12 大萍1987 2026-08-20 14/700 2026-08-23 10:30 by wrm
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 5/250 2026-08-23 07:41 by OEbVnUOu01ol
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 DpSrDtM079iu 2026-08-22 5/250 2026-08-23 04:07 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 7/350 2026-08-23 03:43 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 2JOx3r2CYEgw 2026-08-22 6/300 2026-08-23 03:40 by OEbVnUOu01ol
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 9/450 2026-08-23 03:04 by OEbVnUOu01ol
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 QTy3jDtz1uLt 2026-08-21 11/550 2026-08-23 02:55 by OEbVnUOu01ol
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 2JOx3r2CYEgw 2026-08-21 4/200 2026-08-22 16:52 by sunzitan
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +16 医学老男孩 2026-08-20 20/1000 2026-08-21 21:13 by Ldrop2023
[基金申请] 科研孤儿太难了 +17 我4大白菜 2026-08-20 18/900 2026-08-21 20:57 by zhangev
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭