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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆目的基因
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆目的基因

一直在从一个全基因组不知道的菌种克隆目的基因，最近根据同源性设计了兼并引物。现在遇到了以下这些问题：
1.用兼并引物P目的片段时，使用梯度PCR做的，确定退火温度在58—65之间都有条带，最后回收胶，做连接，转化，蓝白斑筛选，挑了18个白斑进行菌落PCR，发现没有目标条带。（注：因为是新手，切胶回收时切得有些宽，师姐说可能回收率太低）
2.介于上次失败，所以就从头开始做一次克隆，所选的退火温度是62℃。但是这次居然没有P出来。只有一条很淡的条带，这也没法回收啊。
所以请高手指点一下啦。万分感谢。
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nothing isimpossible
1楼 2012-05-27 22:43:14
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yinchu1990

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌落PCR不好  最好提质粒验证
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5楼2012-05-28 09:01:00
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan: 金币+1, ★有帮助 2012-05-28 21:36:03
菌落PCR有时P不出来...可以直接提质粒验证...
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2楼2012-05-28 00:45:26
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 21:56:52
只有一条很淡的条带，这也没法回收啊...这种情况可以再次PCR...直接P的足够量，现在各种pfu价格都不是很高,继续做...
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3楼2012-05-28 00:47:30
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maoyong

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 16:01:13
hraikeyan: 金币+1 2012-05-28 21:36:13
(1)菌落PCR只能做初步判断，最好是直接提质粒再检测；
(2)条带太弱的话，可以把退火温度调一下，或是做二次回收
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4楼2012-05-28 08:16:19
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