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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆目的基因

一直在从一个全基因组不知道的菌种克隆目的基因,最近根据同源性设计了兼并引物。现在遇到了以下这些问题:
1.用兼并引物P目的片段时,使用梯度PCR做的,确定退火温度在58—65之间都有条带,最后回收胶,做连接,转化,蓝白斑筛选,挑了18个白斑进行菌落PCR,发现没有目标条带。(注:因为是新手,切胶回收时切得有些宽,师姐说可能回收率太低)
2.介于上次失败,所以就从头开始做一次克隆,所选的退火温度是62℃。但是这次居然没有P出来。只有一条很淡的条带,这也没法回收啊。
所以请高手指点一下啦。万分感谢。
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nothing isimpossible
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 21:56:52
只有一条很淡的条带,这也没法回收啊...这种情况可以再次PCR...直接P的足够量,现在各种pfu价格都不是很高,继续做...
3楼2012-05-28 00:47:30
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
hraikeyan: 金币+1, 有帮助 2012-05-28 21:36:03
菌落PCR有时P不出来...可以直接提质粒验证...
2楼2012-05-28 00:45:26
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maoyong

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 16:01:13
hraikeyan: 金币+1 2012-05-28 21:36:13
(1)菌落PCR只能做初步判断,最好是直接提质粒再检测;
(2)条带太弱的话,可以把退火温度调一下,或是做二次回收
4楼2012-05-28 08:16:19
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yinchu1990

铜虫 (小有名气)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
菌落PCR不好  最好提质粒验证
5楼2012-05-28 09:01:00
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