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南瓜不说话

银虫 (初入文坛)

[求助] 新的表达一直诱导不出来

最近合成了一段基因，然后按老板的意思用PET-40b作为载体连接，转导进实验室保存的BL21之后，挑取阳性克隆测序，证明目的基因已经转入。
接着就是表达，挑取单克隆37℃ 200rpm  4h摇菌，接着加IPTG诱导剂，28℃ 100rpm 4h，可是跑电泳诱导前后没有明显差异。随后我尝试了不同诱导温度、时间、诱导剂终浓度，结果都没有变化。
请问，有人知道为什么吗？求指导！
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1楼2012-03-08 10:43:39
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qjy_134

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2012-03-08 21:12:56
你连接的片段先转DH5a 或是TOP10，挑取阳性克隆,抽质粒转化BL21(DE3)
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2楼2012-03-08 20:04:43
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南瓜不说话

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by qjy_134 at 2012-03-08 20:04:43:
你连接的片段先转DH5a 或是TOP10，挑取阳性克隆,抽质粒转化BL21(DE3)

我就是先转的DH5a，然后挑取阳性克隆测序没问题，才提质粒转化BL21的
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3楼2012-03-09 09:54:09
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qjy_134

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

那你换rosetta 再试一下。你做诱导表达测试的时候，挑新转化的克隆2-3个到 1ml TB培养基，37度250rpm培养2-3个小时（培养基稍微变浑浊），IPTG终浓度1mm,再同样条件培养2个小时电泳检测一下就OK了
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4楼2012-03-09 11:03:16
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南瓜不说话

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by qjy_134 at 2012-03-09 11:03:16:
那你换rosetta 再试一下。你做诱导表达测试的时候，挑新转化的克隆2-3个到 1ml TB培养基，37度250rpm培养2-3个小时（培养基稍微变浑浊），IPTG终浓度1mm,再同样条件培养2个小时电泳检测一下就OK了

一直都是用的实验室保存的BL21（DE3），你说的rosetta有什么不一样吗？还有为什么换LB为TB培养基，对于发酵有什么改变吗？至于IPTG终浓度1mM也试过了，还是没办法诱导
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5楼2012-03-09 15:46:50
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qjy_134

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

rosetta 菌株带有编码稀有密码子的tRNA, TB培养基OD 高一点诱导也是可以表达出来的，没有像LB 这么严格，你后续的做啥实验
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6楼2012-03-09 16:11:54
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啊Q精神

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
多挑几个单菌落。菌落间表达量往往差很多。
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7楼2012-03-09 16:25:02
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