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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆目的基因

一直在从一个全基因组不知道的菌种克隆目的基因,最近根据同源性设计了兼并引物。现在遇到了以下这些问题:
1.用兼并引物P目的片段时,使用梯度PCR做的,确定退火温度在58—65之间都有条带,最后回收胶,做连接,转化,蓝白斑筛选,挑了18个白斑进行菌落PCR,发现没有目标条带。(注:因为是新手,切胶回收时切得有些宽,师姐说可能回收率太低)
2.介于上次失败,所以就从头开始做一次克隆,所选的退火温度是62℃。但是这次居然没有P出来。只有一条很淡的条带,这也没法回收啊。
所以请高手指点一下啦。万分感谢。
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nothing isimpossible
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jasonwyb123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-05-28 16:01:25
hraikeyan: 金币+2 2012-05-28 21:40:26
你这种情况很正常,需要多尝试一下
第一,你不一定就局限于62°,可以换一个,
第二,切胶时尽量少切没用的空白胶,我有个师兄号称是“刘三刀”,因为再难看的胶他三刀之内都切的不错,可以学习这个,反正尽量把胶切薄,切少
第三,聚落pcr效率有点差,你可以用1ml的管子小摇一下,37°估计2~3h就差不多了吧,具体忘记了,之后菌液p或者抽质粒再做
7楼2012-05-28 14:34:54
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


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hraikeyan: 金币+1, 有帮助 2012-05-28 21:36:03
菌落PCR有时P不出来...可以直接提质粒验证...
2楼2012-05-28 00:45:26
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 21:56:52
只有一条很淡的条带,这也没法回收啊...这种情况可以再次PCR...直接P的足够量,现在各种pfu价格都不是很高,继续做...
3楼2012-05-28 00:47:30
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maoyong

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 16:01:13
hraikeyan: 金币+1 2012-05-28 21:36:13
(1)菌落PCR只能做初步判断,最好是直接提质粒再检测;
(2)条带太弱的话,可以把退火温度调一下,或是做二次回收
4楼2012-05-28 08:16:19
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