应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆目的基因
51/1返回列表
查看: 2439  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 克隆目的基因

一直在从一个全基因组不知道的菌种克隆目的基因，最近根据同源性设计了兼并引物。现在遇到了以下这些问题：
1.用兼并引物P目的片段时，使用梯度PCR做的，确定退火温度在58—65之间都有条带，最后回收胶，做连接，转化，蓝白斑筛选，挑了18个白斑进行菌落PCR，发现没有目标条带。（注：因为是新手，切胶回收时切得有些宽，师姐说可能回收率太低）
2.介于上次失败，所以就从头开始做一次克隆，所选的退火温度是62℃。但是这次居然没有P出来。只有一条很淡的条带，这也没法回收啊。
所以请高手指点一下啦。万分感谢。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
nothing isimpossible
1楼 2012-05-27 22:43:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by trizol11 at 2012-05-28 12:51:13
楼主，你的菌液PCR的反应条件可以给我不？谢谢

我做的是菌落PCR。
95℃      5min
95℃      1min   30个 循环
63℃      1min   30个循环
72℃       1min30s    30个循环
72℃      10min
4℃        ------
赞一下(1人) 回复此楼
nothing isimpossible
8楼2012-05-28 21:40:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hraikeyan: 金币+1, ★有帮助 2012-05-28 21:36:03
菌落PCR有时P不出来...可以直接提质粒验证...
赞一下 回复此楼
2楼2012-05-28 00:45:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 21:56:52
只有一条很淡的条带，这也没法回收啊...这种情况可以再次PCR...直接P的足够量，现在各种pfu价格都不是很高,继续做...
赞一下 回复此楼
3楼2012-05-28 00:47:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

maoyong

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-05-28 16:01:13
hraikeyan: 金币+1 2012-05-28 21:36:13
(1)菌落PCR只能做初步判断，最好是直接提质粒再检测；
(2)条带太弱的话，可以把退火温度调一下，或是做二次回收
赞一下 回复此楼
4楼2012-05-28 08:16:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 12 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-29 13:50 by etmYJ6d2rquH
[教师之家] 某top大学教授说“能够在市场中兑现的能力才是真能力”无比同意！ +8 zju2000 2026-09-26 9/450 2026-09-29 13:47 by ahsoarli
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 10:26 by JzYBbHIXWSrW
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 09:59 by JzYBbHIXWSrW
[教师之家] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 4/200 2026-09-29 09:49 by JzYBbHIXWSrW
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +5 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-29 09:24 by JzYBbHIXWSrW
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:42 by ZvyPK8n6Nfki
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:34 by ZvyPK8n6Nfki
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:28 by ZvyPK8n6Nfki
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:18 by ZvyPK8n6Nfki
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:46 by b8fCuTHqckEt
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:12 by b8fCuTHqckEt
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[有机交流] 同一个分子，一条来自文献，一条来自AI——不告诉你答案，你会选哪条？ +3 tianxiaoxian 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:44 by tianxiaoxian
[找工作] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-28 22:32 by ez6fGg9abYaj
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 3/150 2026-09-28 22:21 by ez6fGg9abYaj
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:15 by ez6fGg9abYaj
[论文投稿] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 3/150 2026-09-28 19:08 by 9lS3ad5oOymn
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 4/200 2026-09-28 18:51 by 9lS3ad5oOymn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭