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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何根据保守序列将基因片段克隆出来
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)

[求助] 如何根据保守序列将基因片段克隆出来

各位大侠：
    本人最近在做一个酶的PCR，不知道酶的氨基酸序列，但是根据得到的一些数据，我们推测为普鲁兰酶，并根据这个酶的保守序列设计了一些兼并引物，想得到一些核酸序列然后进行RACE以得到全基因序列，问题是第一步PCR就没进展，一直P不出来，要不P出来的就是基因组上的一些东西，跟这个酶没一点儿关系，所以寻求大家的帮助，常做这方面的虫友们帮帮忙吧  不胜感激 O(∩_∩)O~
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1楼 2012-10-07 22:12:35
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
根据该酶最具表达可能的组织和时间，取cDNA，RACE 。
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2楼2012-10-08 07:06:31
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houchm0927

金虫 (小有名气)
没做过，祝福
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3楼2012-10-08 09:08:00
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+2, 鼓励一下 2012-10-12 14:38:06
用什么来作为模板的？表达量越高的组织得率越高啊，或者根据上下游的基因来合成引起扩增，得到后再把不要的序列切掉~或者直接用引物拼接，把序列拼起来~
赞一下 回复此楼
你的日子如何，你的力量也必如何！
4楼2012-10-08 16:06:39
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+2, 鼓励一下 2012-10-12 14:38:17
保守位点引物，靠近3端的5个左右核酸不简并（绝对保守的核酸），引物5端简并
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
5楼2012-10-09 08:53:54
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xzx018

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-10-09 08:53:54
保守位点引物，靠近3端的5个左右核酸不简并（绝对保守的核酸），引物5端简并

为什么你说的和codehop的恰恰相反啊，codehop设计出来的都是5端确定 3端兼并
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6楼2012-10-09 10:48:02
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
看天: 金币+2, 鼓励回答 2012-10-12 14:38:29
怎么会呢？应该很成熟的技术了...注意多找些序列，然后比较同源性..选取高度保守的位置设计兼并引物...
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7楼2012-10-09 23:44:54
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by exon2002 at 2012-10-08 07:06:31
根据该酶最具表达可能的组织和时间，取cDNA，RACE 。

我是把产酶菌株的基因组提了出来，然后拿基因组为模板进行的扩增。。。
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8楼2012-10-10 11:11:25
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sxxuan at 2012-10-08 16:06:39
用什么来作为模板的？表达量越高的组织得率越高啊，或者根据上下游的基因来合成引起扩增，得到后再把不要的序列切掉~或者直接用引物拼接，把序列拼起来~

拿产酶菌株的基因组做的模板，这个菌株是我们自己筛出来的
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9楼2012-10-10 11:12:55
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-10-09 08:53:54
保守位点引物，靠近3端的5个左右核酸不简并（绝对保守的核酸），引物5端简并

兼并引物的设计和PCR有什么好的方法吗？第一次做这方面的东西，好多不懂，呵呵
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10楼2012-10-10 11:14:38
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