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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 如何根据保守序列将基因片段克隆出来
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 克隆大虾 at 2012-10-09 23:44:54
怎么会呢？应该很成熟的技术了...注意多找些序列，然后比较同源性..选取高度保守的位置设计兼并引物...

您做这方面是不是挺熟的？兼并引物PCR扩增不出来主要跟什么有关呢？引物最多不超过几个兼并碱基啊？偶是菜鸟，多多指教哈
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11楼2012-10-10 11:17:24
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 水墨蓝 at 2012-10-10 11:17:24
您做这方面是不是挺熟的？兼并引物PCR扩增不出来主要跟什么有关呢？引物最多不超过几个兼并碱基啊？偶是菜鸟，多多指教哈...

3'一定要选个保守的一致的碱基配对吧...
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12楼2012-10-10 12:12:09
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wizardfan: 金币+2, 鼓励发帖交流 2012-10-11 06:40:19
引用回帖:
6楼: Originally posted by xzx018 at 2012-10-09 10:48:02
为什么你说的和codehop的恰恰相反啊，codehop设计出来的都是5端确定 3端兼并...

简并度高扩增难度越大，特别是3端最后3个核酸最好不要简并，我不知道你筛选的普鲁兰酶有没有什么平板筛选方法，要是有的话你可以将基因组随机酶切为几kb的片段构建基因组DNA文库，直接功能筛选获取全长基因。
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
13楼2012-10-10 21:54:54
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 水墨蓝 at 2012-10-10 11:14:38
兼并引物的设计和PCR有什么好的方法吗？第一次做这方面的东西，好多不懂，呵呵...

我觉得简并引物的设计有些注意点和技巧的，与你PCR的效果有很大关系。个人也只是做过些而已，也不是很懂。
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14楼2012-10-10 21:59:42
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水墨蓝

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-10-10 21:54:54
简并度高扩增难度越大，特别是3端最后3个核酸最好不要简并，我不知道你筛选的普鲁兰酶有没有什么平板筛选方法，要是有的话你可以将基因组随机酶切为几kb的片段构建基因组DNA文库，直接功能筛选获取全长基因。...

不知道目的基因内部是否有相应的酶切位点，内切酶的选取不是要摸索一段时间？而且这样随即切，做转化不是工作量特别大吗？
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15楼2012-10-11 10:48:24
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
看天: 金币+3, 鼓励热心交流 2012-10-12 14:39:07
引用回帖:
15楼: Originally posted by 水墨蓝 at 2012-10-11 10:48:24
不知道目的基因内部是否有相应的酶切位点，内切酶的选取不是要摸索一段时间？而且这样随即切，做转化不是工作量特别大吗？...

不用的，一般采用Sau3A I随机不完全酶切，总会切出保含你完整基因的片段，
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16楼2012-10-11 18:18:02
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)
★
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2012-10-12 07:07:00
引用回帖:
8楼: Originally posted by 水墨蓝 at 2012-10-10 13:11:25
我是把产酶菌株的基因组提了出来，然后拿基因组为模板进行的扩增。。。...

基因组扩增出来的片段可能不唯一，且带有内含子。基因组DNA的扩增难度也比较大，然而用菌株会相对容易些。
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17楼2012-10-12 06:36:25
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