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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆大片段的序列如何设计引物
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zhjzhou

木虫 (著名写手)

[求助] 克隆大片段的序列如何设计引物

大家好，我现在要克隆几个3000bp左右的基因，现在设计引物，用cDNA序列和CDS序列比对后，有的前面对上，后面不匹配；有的前面不匹配，后面匹配。而且用ATG前面的序列设计引物，没有特异性，这样该怎么设计引物啊？请大虾指点下，谢谢！
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1楼 2011-10-31 14:19:53
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yunzhifei

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2011-10-31 20:20:59
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2011-10-31 20:20:59
zhjzhou(金币+4): 谢谢！ 2011-10-31 21:06:15
cDNA是mRNA反转录过来的，而CDS序列只是mRNA的一部分，两个肯定对不上啊。你可以将3000bp分成几个片段用匹配的部分多设计几对引物啊，或者花点钱让测序公司帮你做克隆吧，就是贵点，呵呵
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2楼2011-10-31 19:21:36
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zhjzhou

木虫 (著名写手)
谢谢！希望大家多来讨论如何克隆大片段基因的方法。
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3楼2011-10-31 21:05:54
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宗德inter

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

zhjzhou(金币+1): 2011-11-03 10:11:07
个人觉得3000bp的序列不算大其实，个人感觉克隆基因如果用于原核表达建议用cDNA做模板，引物设计可以参考已知的基因信息，我想楼主应该不是克隆一些尚未发现的基因吧
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努力吧phD
4楼2011-11-01 20:55:27
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dog_608582

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！流程说得很清楚了！ 2011-11-02 21:44:35
zhjzhou(金币+3): 谢谢！ 2011-11-03 10:11:28
你是要想得到3KB的cDNA 片段吗？如果是，简单的方法是用RACE的方法，先得到一个小片段，然后利用加头加尾的特殊引物把5‘和3’端的序列拿到后，在根据3‘和5’的序列设计特异性引物把全长的cDNA扩增出来。具体你可以查RACE方法。至于先得到小片段，要根据你已有的信息去设计简并引物什么的。祝好运！另外，3KB不大，引物我都克隆过超过8KB的基因。
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5楼2011-11-02 09:13:06
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