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王雨云

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】真菌的基因克隆与表达 已有6人参与

真菌基因克隆后在酵母中表达的话,是不是都要去除内含子?看文章一般都是通过RT-PCR获得cDNA,然后再做相应的表达。我现在在做一株产纤维素酶真菌的内切酶基因的克隆表达,我直接以总DNA为模板扩增的内切酶基因,测序结果跟网上公布的相应内切酶基因完全一样,然后我就做了后续的构建表达载体,在酵母中表达等相关内容,目前刚构建好表达载体。现在才发现我没有去处内含子,这样是不是不可行的,请教高手解疑了。急切等待解疑,谢谢!
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
没有做过,可能有点复杂,提RNA反转录吧!
关注中。。。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-04-27 17:58:35
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zhaocy8903

木虫 (知名作家)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
必须的。
3楼2010-04-27 20:24:44
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xiangquanju

金虫 (小有名气)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-04-27 22:47
你查过你这个基因的基因组序列吗,可能你的基因里面根本没有内含子,比如酿酒酵母基因组中只有4%的编码基因含有小的内含子。
所以不要着急,建议把这个基因的基因组序列找到,因为你与网上预测的序列比对正确的话,应该就是这种情况
4楼2010-04-27 20:47:26
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王雨云

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by xiangquanju at 2010-04-27 20:47:26:
你查过你这个基因的基因组序列吗,可能你的基因里面根本没有内含子,比如酿酒酵母基因组中只有4%的编码基因含有小的内含子。
所以不要着急,建议把这个基因的基因组序列找到,因为你与网上预测的序列比对正确的话 ...

也就是说通过cds序列确定我所克隆的基因是不是全长,有没有内含子。我现在得到的基因是根据网上公布的来源于同一种真菌的内切酶的mRNA设计的引物,以总DNA为模板扩增而来的基因,测序结果跟他公布的序列一样,但这个公布的基因序列好像不太确定是不是全长(作者没有做相关的文章),一般真菌基因没有内含子的几率较小,那我不是要通过3'和5'race扩全长cds呀,感觉思路混乱了。
5楼2010-04-28 10:57:09
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 王雨云 at 2010-04-28 10:57:09:

也就是说通过cds序列确定我所克隆的基因是不是全长,有没有内含子。我现在得到的基因是根据网上公布的来源于同一种真菌的内切酶的mRNA设计的引物,以总DNA为模板扩增而来的基因,测序结果跟他公布的序列一样,但 ...

感觉你这个不用做RACE,首先你用基因组获得了基因序列,这个序列存在两种情况,包含内含子或者不包含,现在你跟网上公布的mRNA序列比对了,是一致的,那么基本可以确定是不包含内含子的。

如果你担心网上公布的结果不准确,那么你可以提取总RNA,并且一定要将DNA用DNA酶消化完全,之后再用你的引物扩增mRNA的全长,克隆测序,比对一下和之前的结果是否一致,确定是否包含内含子
6楼2010-04-28 13:30:00
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王雨云

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-28 13:30:00:

感觉你这个不用做RACE,首先你用基因组获得了基因序列,这个序列存在两种情况,包含内含子或者不包含,现在你跟网上公布的mRNA序列比对了,是一致的,那么基本可以确定是不包含内含子的。

如果你担心网上公布 ...

今天我也问过实验室的师兄,他说的情况你跟差不多,多谢指教!
7楼2010-04-28 19:38:16
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xiaohaozi9876

铁虫 (小有名气)

必须去除内含子,网上的序列不能完全相信

你必须提取rna,泡一下pcr,看有没有差异,有差异的话,你就得从头开始做了。

[ Last edited by xiaohaozi9876 on 2012-7-19 at 12:15 ]
Onceinamoment,wethinkoneselfgrowup,oneday,wefinallyfound...
8楼2012-07-19 12:13:24
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