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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】真菌的基因克隆与表达
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王雨云

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】真菌的基因克隆与表达 已有6人参与

真菌基因克隆后在酵母中表达的话，是不是都要去除内含子？看文章一般都是通过RT-PCR获得cDNA，然后再做相应的表达。我现在在做一株产纤维素酶真菌的内切酶基因的克隆表达，我直接以总DNA为模板扩增的内切酶基因，测序结果跟网上公布的相应内切酶基因完全一样，然后我就做了后续的构建表达载体，在酵母中表达等相关内容，目前刚构建好表达载体。现在才发现我没有去处内含子，这样是不是不可行的，请教高手解疑了。急切等待解疑，谢谢！
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1楼 2010-04-27 17:26:44
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by 王雨云 at 2010-04-28 10:57:09:

也就是说通过cds序列确定我所克隆的基因是不是全长，有没有内含子。我现在得到的基因是根据网上公布的来源于同一种真菌的内切酶的mRNA设计的引物，以总DNA为模板扩增而来的基因，测序结果跟他公布的序列一样，但 ...

感觉你这个不用做RACE，首先你用基因组获得了基因序列，这个序列存在两种情况，包含内含子或者不包含，现在你跟网上公布的mRNA序列比对了，是一致的，那么基本可以确定是不包含内含子的。

如果你担心网上公布的结果不准确，那么你可以提取总RNA，并且一定要将DNA用DNA酶消化完全，之后再用你的引物扩增mRNA的全长，克隆测序，比对一下和之前的结果是否一致，确定是否包含内含子
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6楼2010-04-28 13:30:00
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
没有做过，可能有点复杂，提RNA反转录吧！
关注中。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-04-27 17:58:35
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xiangquanju

金虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-27 22:47
你查过你这个基因的基因组序列吗，可能你的基因里面根本没有内含子，比如酿酒酵母基因组中只有4%的编码基因含有小的内含子。
所以不要着急，建议把这个基因的基因组序列找到，因为你与网上预测的序列比对正确的话，应该就是这种情况
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4楼2010-04-27 20:47:26
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王雨云

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xiangquanju at 2010-04-27 20:47:26:
你查过你这个基因的基因组序列吗，可能你的基因里面根本没有内含子，比如酿酒酵母基因组中只有4%的编码基因含有小的内含子。
所以不要着急，建议把这个基因的基因组序列找到，因为你与网上预测的序列比对正确的话 ...

也就是说通过cds序列确定我所克隆的基因是不是全长，有没有内含子。我现在得到的基因是根据网上公布的来源于同一种真菌的内切酶的mRNA设计的引物，以总DNA为模板扩增而来的基因，测序结果跟他公布的序列一样，但这个公布的基因序列好像不太确定是不是全长（作者没有做相关的文章），一般真菌基因没有内含子的几率较小，那我不是要通过3'和5'race扩全长cds呀,感觉思路混乱了。
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5楼2010-04-28 10:57:09
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