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ruililian09

银虫 (小有名气)

[求助] 我有几个克隆和基因重组的基本问题不太清楚，请各位帮帮忙！

1、DH5α和JM109这两个菌株在做克隆时有什么区别，我看的文章里，做克隆时两者都用。
2、做转化时，我看文献里都会用X-Gal和IPTG来做蓝白斑筛选，但是我们用T载连接转化到DH5α中的时候，是不用蓝白斑来筛选的，出现阳性菌落的时候就挑单菌落做菌落PCR验证，这样是不是就可以代替蓝白斑筛选了，甚至比前者更有说服力？
3、用BL21和毕赤酵母表达时，一般用什么酶与载体连接呢？我的理解是根据设计引物时加的酶切位点来定，可不知道为什么老师还让我查。
4、做易错PCR和DNA Shuffling时怎么确定重组的条件呢？例如：PCR体系，程序，内切酶和无引物PCR的程序等等。或者摸索重组条件的时候的依据有哪些？易错PCR是将突变的碱基控制在一定的范围之内吗，那不是没摸索一次就要测一次序？
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1楼 2012-09-28 10:36:39
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回帖置顶 ( 共有1个 )

gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 回帖置顶 2012-09-28 11:32:20
1949stone: MolEPI+1, ok 2012-09-28 11:32:27
1、 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。JM109菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
2、严格来说，蓝白斑筛选还是要做的，筛选出白班之后再做PCR验证，这样假阳性概率就小。
3、选择酶切位点很重要，不光要切下来，下一步还要能连接上去，查阅文献是对的，好好筛选，挑选常见的，经济的，连接效率高的。
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持之以恒、永不放弃！
3楼2012-09-28 11:12:46
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普通回帖

ysn5048

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
回答楼主第二个问题，蓝白斑可以大量排除假阳性，减少后续工作量，建议楼主使用蓝白斑筛选
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有时候，一句话，可以改变未来
2楼2012-09-28 10:59:50
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 金币+1, 很好 2012-09-28 17:19:34
BL21表达我是用pET-28a(+)，毕赤酵母没做过。做不做蓝白斑筛选可以根据你的情况而定。假阳性多的时候最好做。可能是我比较懒吧，通常是做菌落PCR筛。即使做了菌落PCR，还是要再提质粒酶切鉴定的。
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4楼2012-09-28 15:01:02
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Happy实验室

新虫 (初入文坛)
第四个问题：可以考虑设计带有突变位点的大片段引物，然后将片段放在一起杂交，也可以做到
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5楼2012-10-02 22:54:53
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wangqi20092

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-07 17:21:26
1，M109直接百度搜索M109菌株，第一个就是答案。2蓝白斑筛选和菌落PCR都是初筛，后面还要提质粒，做双酶切验证，最后测序。3，用什么酶和载体连接？酶和载体连接干嘛啊，这个问题有点不清楚。片段和载体连接一般都用T4 DNA ligase。
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6楼2012-10-04 12:10:18
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ruililian09

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Happy实验室 at 2012-10-02 22:54:53
第四个问题：可以考虑设计带有突变位点的大片段引物，然后将片段放在一起杂交，也可以做到

设计带有突变位点的引物对酶的结构和功能要比较熟悉才行吧？我打算做的就是随机的突变，是不是行不通呢？
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7楼2012-10-07 12:46:08
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