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ruililian09

银虫 (小有名气)

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专业: 生物化学

[求助] 我有几个克隆和基因重组的基本问题不太清楚，请各位帮帮忙！

1、DH5α和JM109这两个菌株在做克隆时有什么区别，我看的文章里，做克隆时两者都用。
2、做转化时，我看文献里都会用X-Gal和IPTG来做蓝白斑筛选，但是我们用T载连接转化到DH5α中的时候，是不用蓝白斑来筛选的，出现阳性菌落的时候就挑单菌落做菌落PCR验证，这样是不是就可以代替蓝白斑筛选了，甚至比前者更有说服力？
3、用BL21和毕赤酵母表达时，一般用什么酶与载体连接呢？我的理解是根据设计引物时加的酶切位点来定，可不知道为什么老师还让我查。
4、做易错PCR和DNA Shuffling时怎么确定重组的条件呢？例如：PCR体系，程序，内切酶和无引物PCR的程序等等。或者摸索重组条件的时候的依据有哪些？易错PCR是将突变的碱基控制在一定的范围之内吗，那不是没摸索一次就要测一次序？

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1楼2012-09-28 10:36:39

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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

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专业: 质谱分析

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1949stone: 回帖置顶 2012-09-28 11:32:20
1949stone: MolEPI+1, ok 2012-09-28 11:32:27

1、 DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。JM109菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。
2、严格来说，蓝白斑筛选还是要做的，筛选出白班之后再做PCR验证，这样假阳性概率就小。
3、选择酶切位点很重要，不光要切下来，下一步还要能连接上去，查阅文献是对的，好好筛选，挑选常见的，经济的，连接效率高的。