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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 克隆基因为什么一直连不到载体上
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gyesang

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我注意到了你的反馈，现想详细了解一下你的实验设计
1. 你的目的载体是什么？用的哪两个酶进行双酶切的，以及酶来自哪个公司？
你是如何确定目的载体双酶切确定可以切开的？

2. 含有同样酶切位点的目的片段先连到PMD19-T上，你是指pMD19-T而不是pMD19-T simple（这一点很重要）？

3. 却又连不到目的载体上？
你是指什么呢？是转化后没有菌落长出，还是长出的菌落都是载体自连？

做分子克隆，连不上载体的原因很多，希望你能说出详细的实验过程，好让虫友们针对你的具体的实验进行查找问题，否则简单的一个究竟是什么原因呢，真的很难说清楚原因。
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11楼2013-07-06 19:04:48
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gyesang

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引用回帖:
8楼: Originally posted by 凉皮 at 2013-07-05 11:33:41
我把目标载体酶切1小时后，用未酶切的目标载体做对照，跑琼脂糖电泳胶，结果切后的产物是3条带，这不就证明是切开了。转化后都是目标载体自连的，没有连入目的基因的滞后的条带。但是该目的基因是可以连到PMD-19T载 ...

“我把目标载体酶切1小时后，用未酶切的目标载体做对照，跑琼脂糖电泳胶，结果切后的产物是3条带，这不就证明是切开了。”

不明白这里为什么切后的产物是3条带，你用的双酶切中有一个酶在载体上不是单酶切位点？

能否告知，你用的是什么目标载体，以及用的什么限制酶？

感谢你积极向版主反馈问题！
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12楼2013-07-06 19:12:08
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