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凉皮

铜虫 (初入文坛)

[求助] 克隆基因为什么一直连不到载体上

目的载体双酶切确定可以切开,含有同样酶切位点的目的片段先连到PMD19-T上的,之后把目的片段从PMD-19-T载体上切下来之后,却又连不到目的载体上了,究竟是什么原因呢?
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

我注意到了你的反馈,现想详细了解一下你的实验设计
1. 你的目的载体是什么?用的哪两个酶进行双酶切的,以及酶来自哪个公司?
你是如何确定目的载体双酶切确定可以切开的?

2. 含有同样酶切位点的目的片段先连到PMD19-T上,你是指pMD19-T而不是pMD19-T simple(这一点很重要)?

3. 却又连不到目的载体上?
你是指什么呢?是转化后没有菌落长出,还是长出的菌落都是载体自连?

做分子克隆,连不上载体的原因很多,希望你能说出详细的实验过程,好让虫友们针对你的具体的实验进行查找问题,否则简单的一个究竟是什么原因呢,真的很难说清楚原因。
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
11楼2013-07-06 19:04:48
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-07-04 22:18:52
1,载体和插入片段要有一定mol比。。否则很难连上去。,建议胶回收后分别测浓度,然后计算,载体0.03pmol。插入片段0.3pmol。。这样会很容易连
2楼2013-07-04 21:58:15
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-07-05 15:03:50
gyesang: 编辑内容 2013-07-06 19:06
能不能说的再详细一些,转化后没有菌落还是都是false positive?
你怎么确定你的目标载体是否是切好的呢?这个可能是关键

[ Last edited by gyesang on 2013-7-6 at 19:06 ]
4楼2013-07-05 08:22:16
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grape_vine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
引用回帖:
2楼: Originally posted by 武穆大成 at 2013-07-04 21:58:15
1,载体和插入片段要有一定mol比。。否则很难连上去。,建议胶回收后分别测浓度,然后计算,载体0.03pmol。插入片段0.3pmol。。这样会很容易连

摩尔比确实很重要.这个建议你可以去试.
5楼2013-07-05 10:11:28
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