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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

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[交流] 用pMD 19-T做克隆之后用哪对通用引物做菌落PCR以及测序呢？

各位大虾：我用Takara的pMD 19-T载体做PCR产物的克隆实验，在菌落PCR那一步使用我原始的PCR引物（这对引物正向引物是特异性的，反向引物是通用的），电泳检测条带跟我的目的条带位置是吻合的，但是师姐说我应该用M13通用引物来做PCR，用自己的引物可能会是假阳性，目前菌液正在测序中，现在我有两个问题：
1、菌落PCR使用我自己的引物（这对引物正向引物是特异性的，反向引物是通用的）究竟可不可以呢？
2、如果要用通用引物，应该选择哪对引物呢？请附序列（在网上查M13引物有很多，有些糊涂了）
新手上路，多谢各位指教！

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1楼 2013-12-14 18:08:08

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cicelyzh

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柠檬可乐星: 金币+5 2013-12-16 10:02:22

测序时一般要用载体上的通用引物，因为靠近引物附近的序列信号很差，有一二十个碱基是测不出来的。用基因特异引物可能造成测序结果里缺失部分序列。用载体上的引物可以避免这个问题。如果你的序列在700bp以下，可以用一个引物测通。如果你的序列在700-1400，需要用一对引物。因为T载体的插入位点在中间，用通用引物中的任何一对都可以。如果你的序列超过1400，你需要设计中间引物。