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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)


[交流] 用pMD 19-T做克隆之后用哪对通用引物做菌落PCR以及测序呢?

各位大虾:我用Takara的pMD 19-T载体做PCR产物的克隆实验,在菌落PCR那一步使用我原始的PCR引物(这对引物正向引物是特异性的,反向引物是通用的),电泳检测条带跟我的目的条带位置是吻合的,但是师姐说我应该用M13通用引物来做PCR,用自己的引物可能会是假阳性,目前菌液正在测序中,现在我有两个问题:
1、菌落PCR使用我自己的引物(这对引物正向引物是特异性的,反向引物是通用的)究竟可不可以呢?
2、如果要用通用引物,应该选择哪对引物呢?请附序列(在网上查M13引物有很多,有些糊涂了)
新手上路,多谢各位指教!
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)


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gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-12-15 18:22:48
柠檬可乐星: 金币+5 2013-12-16 10:02:22
测序时一般要用载体上的通用引物,因为靠近引物附近的序列信号很差,有一二十个碱基是测不出来的。用基因特异引物可能造成测序结果里缺失部分序列。用载体上的引物可以避免这个问题。如果你的序列在700bp以下,可以用一个引物测通。如果你的序列在700-1400,需要用一对引物。因为T载体的插入位点在中间,用通用引物中的任何一对都可以。如果你的序列超过1400,你需要设计中间引物。
2楼2013-12-15 09:47:55
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柠檬可乐星: 金币+3 2013-12-16 10:02:31
T载体用你查到的M13引物都可以,M13引物也没有很多,共有两对,正反向各有两条都是可以用来测序
3楼2013-12-15 21:55:37
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yuren2009

木虫 (正式写手)


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柠檬可乐星: 金币+2 2013-12-16 10:02:37
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-01-27 20:57:55
自己的引物就可以,没有通用引物你还要合成。至于假阳性,当然也是概率问题,多选几个菌落PCR验证目的片段,我用的也是19-T,直接用自己的引物PCR验证的,而且测序都成功了。

[ 发自小木虫客户端 ]
4楼2013-12-16 09:27:42
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r-rainbow

铁虫 (小有名气)


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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2014-01-27 20:58:22
直接用你的引物做就行 假阳性会有的 多找你个就没问题
6楼2013-12-16 16:05:36
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jonew

木虫 (正式写手)


学习了
7楼2013-12-21 12:40:55
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心雨sugar

新虫 (初入文坛)


★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2014-01-27 20:58:33
我一般是用自己的引物,然后再酶切检测
8楼2013-12-21 20:14:19
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简单回复
sjmr12215楼
2013-12-16 10:16   回复  
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