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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 用pMD 19-T做克隆之后用哪对通用引物做菌落PCR以及测序呢？
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柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

[交流] 用pMD 19-T做克隆之后用哪对通用引物做菌落PCR以及测序呢？

各位大虾：我用Takara的pMD 19-T载体做PCR产物的克隆实验，在菌落PCR那一步使用我原始的PCR引物（这对引物正向引物是特异性的，反向引物是通用的），电泳检测条带跟我的目的条带位置是吻合的，但是师姐说我应该用M13通用引物来做PCR，用自己的引物可能会是假阳性，目前菌液正在测序中，现在我有两个问题：
1、菌落PCR使用我自己的引物（这对引物正向引物是特异性的，反向引物是通用的）究竟可不可以呢？
2、如果要用通用引物，应该选择哪对引物呢？请附序列（在网上查M13引物有很多，有些糊涂了）
新手上路，多谢各位指教！
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1楼 2013-12-14 18:08:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-15 18:22:48
柠檬可乐星: 金币+5 2013-12-16 10:02:22
测序时一般要用载体上的通用引物，因为靠近引物附近的序列信号很差，有一二十个碱基是测不出来的。用基因特异引物可能造成测序结果里缺失部分序列。用载体上的引物可以避免这个问题。如果你的序列在700bp以下，可以用一个引物测通。如果你的序列在700-1400，需要用一对引物。因为T载体的插入位点在中间，用通用引物中的任何一对都可以。如果你的序列超过1400，你需要设计中间引物。
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2楼2013-12-15 09:47:55
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)
★ ★ ★ ★
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柠檬可乐星: 金币+3 2013-12-16 10:02:31
T载体用你查到的M13引物都可以，M13引物也没有很多，共有两对，正反向各有两条都是可以用来测序
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3楼2013-12-15 21:55:37
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yuren2009

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
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柠檬可乐星: 金币+2 2013-12-16 10:02:37
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:57:55
自己的引物就可以，没有通用引物你还要合成。至于假阳性，当然也是概率问题，多选几个菌落PCR验证目的片段，我用的也是19-T,直接用自己的引物PCR验证的，而且测序都成功了。

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4楼2013-12-16 09:27:42
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r-rainbow

铁虫 (小有名气)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:58:22
直接用你的引物做就行 假阳性会有的 多找你个就没问题
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6楼2013-12-16 16:05:36
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jonew

木虫 (正式写手)
学习了
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7楼2013-12-21 12:40:55
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心雨sugar

新虫 (初入文坛)
★ ★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:58:33
我一般是用自己的引物，然后再酶切检测
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8楼2013-12-21 20:14:19
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sjmr12215楼
2013-12-16 10:16   回复  
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