24小时热门版块排行榜

返回列表

柠檬可乐星

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 2268.5
帖子: 250
在线: 48.1小时
虫号: 2414119

[交流] 用pMD 19-T做克隆之后用哪对通用引物做菌落PCR以及测序呢？

各位大虾：我用Takara的pMD 19-T载体做PCR产物的克隆实验，在菌落PCR那一步使用我原始的PCR引物（这对引物正向引物是特异性的，反向引物是通用的），电泳检测条带跟我的目的条带位置是吻合的，但是师姐说我应该用M13通用引物来做PCR，用自己的引物可能会是假阳性，目前菌液正在测序中，现在我有两个问题：
1、菌落PCR使用我自己的引物（这对引物正向引物是特异性的，反向引物是通用的）究竟可不可以呢？
2、如果要用通用引物，应该选择哪对引物呢？请附序列（在网上查M13引物有很多，有些糊涂了）
新手上路，多谢各位指教！

回复此楼

» 猜你喜欢

为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种? 已经有5人回复
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》已经有3人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有199人回复
求助食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社电子版已经有5人回复
胶体几丁质的结晶度？已经有0人回复
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士已经有2人回复
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线已经有5人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

关于测序的问题-双酶切和PCR验证均是对的但是测序后有重叠现象已经有8人回复
关于构载体过程中PCR验证正确但是测序为空载体的困惑已经有7人回复
M13通用引物为什么有这么多种？已经有6人回复
PCR产物不做纯化和胶回收，直接TA克隆可以吗？已经有13人回复
载体弄混了，对DNA的测序有影响吗已经有7人回复
蓝白斑筛选没问题，挑白色克隆测序无目的基因序列已经有9人回复
哪位好心人给我讲讲DGGE后切胶回收、连接、转化、克隆到测序的过程？？已经有7人回复
测序结果分析，以及RACE引物设计。求助呢已经有3人回复
我的单克隆菌落PCR除了很明确的目的条带外。在2000多上面还有微弱的两条带。已经有14人回复
用PCR扩增后的DNA如何测序？不能直接用PCR就知道是什么菌种之类的吧？已经有6人回复
求放线菌通用引物。已经有4人回复
关于常用载体通用引物的问题已经有5人回复
测序结果发现，在引物位置多了一位碱基，是什么原因引起的？已经有16人回复
微生物多样性研究的几个问题已经有10人回复
pMD-19-T载体的大小是多少啊？已经有9人回复
通用引物扩增细菌16S rDNA 已经有13人回复
连接转化后菌落PCR验证出现非特异性扩增已经有5人回复
【求助/交流】分子克隆后M13引物PCR扩增已经有32人回复
【求助/交流】pMD 19-T Simple 载体测序通用引物退度温度已经有5人回复
【求助/交流】菌落PCR问题已经有7人回复
【求助/交流】菌落PCR扩出来的片段不是目的片段，咋办啊？？？？已经有9人回复
【求助/交流】菌落PCR问题已经有23人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:
查看全部散金贴

1楼2013-12-14 18:08:08

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

MolEPI: 10
应助: 1662 (讲师)
金币: 8693.8
帖子: 3516
在线: 456小时
虫号: 1614001

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-15 18:22:48
柠檬可乐星: 金币+5 2013-12-16 10:02:22

测序时一般要用载体上的通用引物，因为靠近引物附近的序列信号很差，有一二十个碱基是测不出来的。用基因特异引物可能造成测序结果里缺失部分序列。用载体上的引物可以避免这个问题。如果你的序列在700bp以下，可以用一个引物测通。如果你的序列在700-1400，需要用一对引物。因为T载体的插入位点在中间，用通用引物中的任何一对都可以。如果你的序列超过1400，你需要设计中间引物。