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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物不做纯化和胶回收，直接TA克隆可以吗？
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履霜

木虫 (正式写手)

[求助] PCR产物不做纯化和胶回收，直接TA克隆可以吗？

如题，
我做的巢式PCR，跑胶之后亮度很好，没有杂带。Taq酶里面预混有染料，我能不能直接连载体做克隆，用pMD18？手边没有胶回收试剂盒啊。
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1楼 2013-03-05 14:30:47
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zltj2008

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
履霜: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-06 13:10:56
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-06 17:18:24
不用盒子回收，用乙醇和醋酸钠沉淀，干燥后拿水溶了。再连T载体就行了
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4楼2013-03-06 11:19:28
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 专家考核, 鼓励交流经验，呵呵 2013-03-06 17:18:16
不可，影响下面的酶切酶连活性
涉及酶的操作都不要疏忽，酶对反应条件相应要求较高，
pcr体系里，看着澄清透明，看不见的是pH值，盐离子浓度，都会给内切酶带来麻烦。

当然不排除有很小几率做出后续试验（本人师兄拿自来水都能提出RNA来，叹服），理论上一定要回收的
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3楼2013-03-05 15:53:17
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beer胖

新虫 (小有名气)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-31 16:13:03
最好是回收一下。
pcr产物里面的离子等对T克隆有影响，而且pcr产物也不能保证没有杂带，最终T克隆的转化子会很乱，可能不仅仅是自己想要的片段的转化子了。
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5楼2013-03-07 21:52:06
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cdl007

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-04-27 14:59:17
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-05-31 16:13:19
引用回帖:
6楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-27 13:23:02
做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
克隆后，用含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单 ...

没有目的条带，显然是没有转化进去
没有蓝白斑比较可疑，实际上应该说都是白斑，没有蓝斑吧？板子放4℃容易显蓝斑
如果你pcr出来，没有蓝斑，可能是x-gal出问题了
但是你pcr都没出来，那就重做连接，加大目的片段与载体的比例
最重要的是加入一个阳性质粒转化对照，确保转化、筛选过程没有问题
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9楼2013-03-27 13:33:34
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普通回帖

无为书生

铁虫 (小有名气)
可以试试，T载体还是很好连的。不过PCR体系里有很多的东东，对连接有影响！
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2楼2013-03-05 14:58:43
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生物生物

新虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验！ 2013-05-31 16:13:36
引用回帖:
3楼: Originally posted by cdl007 at 2013-03-05 15:53:17
不可，影响下面的酶切酶连活性
涉及酶的操作都不要疏忽，酶对反应条件相应要求较高，
pcr体系里，看着澄清透明，看不见的是pH值，盐离子浓度，都会给内切酶带来麻烦。

当然不排除有很小几率做出后续试验（本人 ...

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
克隆后，用含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
非常谢谢！
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6楼2013-03-27 13:23:02
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生物生物

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-05 14:58:43
可以试试，T载体还是很好连的。不过PCR体系里有很多的东东，对连接有影响！

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
克隆后，用含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
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7楼2013-03-27 13:23:44
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生物生物

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by beer胖 at 2013-03-07 21:52:06
最好是回收一下。
pcr产物里面的离子等对T克隆有影响，而且pcr产物也不能保证没有杂带，最终T克隆的转化子会很乱，可能不仅仅是自己想要的片段的转化子了。

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
克隆后，用含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
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8楼2013-03-27 13:23:57
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无为书生

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-27 13:23:44
做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
克隆后，用含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单 ...

如果用pMD18，插入或没插入会有相应的蓝白斑，看不到蓝白斑我认为是你的pMD18很可能根本就没有转到菌里面，至于单菌落可能是污染的有氨苄抗性的杂菌，没有做，只是小推断。
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10楼2013-03-27 15:45:20
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