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履霜

木虫 (正式写手)

[求助] PCR产物不做纯化和胶回收,直接TA克隆可以吗?

如题,
我做的巢式PCR,跑胶之后亮度很好,没有杂带。Taq酶里面预混有染料,我能不能直接连载体做克隆,用pMD18?手边没有胶回收试剂盒啊。
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zltj2008

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
履霜: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-06 13:10:56
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-06 17:18:24
不用盒子回收,用乙醇和醋酸钠沉淀,干燥后拿水溶了。再连T载体就行了
4楼2013-03-06 11:19:28
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 专家考核, 鼓励交流经验,呵呵 2013-03-06 17:18:16
不可,影响下面的酶切酶连活性
涉及酶的操作都不要疏忽,酶对反应条件相应要求较高,
pcr体系里,看着澄清透明,看不见的是pH值,盐离子浓度,都会给内切酶带来麻烦。

当然不排除有很小几率做出后续试验(本人师兄拿自来水都能提出RNA来,叹服),理论上一定要回收的
3楼2013-03-05 15:53:17
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beer胖

新虫 (小有名气)


gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-31 16:13:03
最好是回收一下。
pcr产物里面的离子等对T克隆有影响,而且pcr产物也不能保证没有杂带,最终T克隆的转化子会很乱,可能不仅仅是自己想要的片段的转化子了。
5楼2013-03-07 21:52:06
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cdl007

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-04-27 14:59:17
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-05-31 16:13:19
引用回帖:
6楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-27 13:23:02
做TA克隆时,直接用PCR产物跟pMD18载体连接,我的PCR产物结果较好,目标片段长度263bp,电泳时看不出非特异扩增,有引物二聚体。
克隆后,用含X-gal,IPTG,Amp的LB固体培养基平板筛选,看不到蓝白班,但有许多单 ...

没有目的条带,显然是没有转化进去
没有蓝白斑比较可疑,实际上应该说都是白斑,没有蓝斑吧?板子放4℃容易显蓝斑
如果你pcr出来,没有蓝斑,可能是x-gal出问题了
但是你pcr都没出来,那就重做连接,加大目的片段与载体的比例
最重要的是加入一个阳性质粒转化对照,确保转化、筛选过程没有问题
9楼2013-03-27 13:33:34
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普通回帖

无为书生

铁虫 (小有名气)

可以试试,T载体还是很好连的。不过PCR体系里有很多的东东,对连接有影响!
2楼2013-03-05 14:58:43
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生物生物

新虫 (初入文坛)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流经验! 2013-05-31 16:13:36
引用回帖:
3楼: Originally posted by cdl007 at 2013-03-05 15:53:17
不可,影响下面的酶切酶连活性
涉及酶的操作都不要疏忽,酶对反应条件相应要求较高,
pcr体系里,看着澄清透明,看不见的是pH值,盐离子浓度,都会给内切酶带来麻烦。

当然不排除有很小几率做出后续试验(本人 ...

做TA克隆时,直接用PCR产物跟pMD18载体连接,我的PCR产物结果较好,目标片段长度263bp,电泳时看不出非特异扩增,有引物二聚体。
克隆后,用含X-gal,IPTG,Amp的LB固体培养基平板筛选,看不到蓝白班,但有许多单菌落,挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时,用菌液PCR检测(所用引物于前面pcr的引物相同,反映条件也相同,只是94度预变性时间改为10分钟)。但是检测结果没有目的条带,只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您,这是什么原因?
非常谢谢!
6楼2013-03-27 13:23:02
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生物生物

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-05 14:58:43
可以试试,T载体还是很好连的。不过PCR体系里有很多的东东,对连接有影响!

做TA克隆时,直接用PCR产物跟pMD18载体连接,我的PCR产物结果较好,目标片段长度263bp,电泳时看不出非特异扩增,有引物二聚体。
克隆后,用含X-gal,IPTG,Amp的LB固体培养基平板筛选,看不到蓝白班,但有许多单菌落,挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时,用菌液PCR检测(所用引物于前面pcr的引物相同,反映条件也相同,只是94度预变性时间改为10分钟)。但是检测结果没有目的条带,只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您,这是什么原因?
7楼2013-03-27 13:23:44
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生物生物

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by beer胖 at 2013-03-07 21:52:06
最好是回收一下。
pcr产物里面的离子等对T克隆有影响,而且pcr产物也不能保证没有杂带,最终T克隆的转化子会很乱,可能不仅仅是自己想要的片段的转化子了。

做TA克隆时,直接用PCR产物跟pMD18载体连接,我的PCR产物结果较好,目标片段长度263bp,电泳时看不出非特异扩增,有引物二聚体。
克隆后,用含X-gal,IPTG,Amp的LB固体培养基平板筛选,看不到蓝白班,但有许多单菌落,挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时,用菌液PCR检测(所用引物于前面pcr的引物相同,反映条件也相同,只是94度预变性时间改为10分钟)。但是检测结果没有目的条带,只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您,这是什么原因?
8楼2013-03-27 13:23:57
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无为书生

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 生物生物 at 2013-03-27 13:23:44
做TA克隆时,直接用PCR产物跟pMD18载体连接,我的PCR产物结果较好,目标片段长度263bp,电泳时看不出非特异扩增,有引物二聚体。
克隆后,用含X-gal,IPTG,Amp的LB固体培养基平板筛选,看不到蓝白班,但有许多单 ...

如果用pMD18,插入或没插入会有相应的蓝白斑,看不到蓝白斑我认为是你的pMD18很可能根本就没有转到菌里面,至于单菌落可能是污染的有氨苄抗性的杂菌,没有做,只是小推断。
10楼2013-03-27 15:45:20
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