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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物不做纯化和胶回收，直接TA克隆可以吗？
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履霜

木虫 (正式写手)

[求助] PCR产物不做纯化和胶回收，直接TA克隆可以吗？

如题，
我做的巢式PCR，跑胶之后亮度很好，没有杂带。Taq酶里面预混有染料，我能不能直接连载体做克隆，用pMD18？手边没有胶回收试剂盒啊。
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1楼 2013-03-05 14:30:47
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生物生物

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-05 14:58:43
可以试试，T载体还是很好连的。不过PCR体系里有很多的东东，对连接有影响！

做TA克隆时，直接用PCR产物跟pMD18载体连接，我的PCR产物结果较好，目标片段长度263bp，电泳时看不出非特异扩增，有引物二聚体。
克隆后，用含X-gal，IPTG，Amp的LB固体培养基平板筛选，看不到蓝白班，但有许多单菌落，挑单菌落于含1ml LB液体培养基的试管中摇菌10小时，用菌液PCR检测（所用引物于前面pcr的引物相同，反映条件也相同，只是94度预变性时间改为10分钟）。但是检测结果没有目的条带，只有100bp左右的引物二聚体。
想问问您，这是什么原因？
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7楼2013-03-27 13:23:44
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无为书生

铁虫 (小有名气)
可以试试，T载体还是很好连的。不过PCR体系里有很多的东东，对连接有影响！
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2楼2013-03-05 14:58:43
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cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 专家考核, 鼓励交流经验，呵呵 2013-03-06 17:18:16
不可，影响下面的酶切酶连活性
涉及酶的操作都不要疏忽，酶对反应条件相应要求较高，
pcr体系里，看着澄清透明，看不见的是pH值，盐离子浓度，都会给内切酶带来麻烦。

当然不排除有很小几率做出后续试验（本人师兄拿自来水都能提出RNA来，叹服），理论上一定要回收的
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3楼2013-03-05 15:53:17
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zltj2008

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
履霜: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-03-06 13:10:56
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-03-06 17:18:24
不用盒子回收，用乙醇和醋酸钠沉淀，干燥后拿水溶了。再连T载体就行了
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2013-03-06 11:19:28
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