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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于克隆技术——pcr产物测序问题
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zishilanxuan

金虫 (小有名气)

[求助] 关于克隆技术——pcr产物测序问题

各位大侠，我想请问一下，我从一种菌中P出来一条带，然后我进行胶回收，连接T载体，将连接产物转到感受态DH5α中，通过蓝白斑筛选，挑取白斑进行培养，能P出我胶回收的带，然后我把它送去测序，但测序结果不是我要的目的基因，而且测序结果在我菌的全序列里也没有匹配的，我想问一下，这是哪里出了问题啊？正常即使不是我的目的基因，是不是测出来的在我的全序列里也应该能有匹配的啊？希望大家能够帮我看看问题出在哪?
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1楼 2012-10-16 15:59:52
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水寒冰006

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你p的条带有多大？如果小于1000bp的话，你直接PCR完了送去测序就行，两端引物测，先确定你p出来的片段是对的。
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2楼2012-10-16 16:50:29
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liuguilin

禁言 (文学泰斗)

文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献文献杰出贡献

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼上正解，p完可以直接侧，一端可以测几百bp.
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3楼2012-10-16 17:15:10
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zishilanxuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 水寒冰006 at 2012-10-16 16:50:29
你p的条带有多大？如果小于1000bp的话，你直接PCR完了送去测序就行，两端引物测，先确定你p出来的片段是对的。

我的目的基因大概在1910左右，加上引物，保守序列大概在2080多吧
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4楼2012-10-16 19:46:31
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yananhl

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也是出现这种现象啊，估计是连接出问题吧，片段太大的原因，你挑菌的时候菌长的怎么样，阳性克隆检测结果又怎么样呢？大片段的有时候连接不好，会出现这种问题。
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5楼2012-10-17 09:08:33
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yananhl

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

找到原因没，找到原因了告诉一声哈，我也是出现这种现象，不知道怎么回事。
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6楼2012-10-17 11:31:05
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zishilanxuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yananhl at 2012-10-17 09:08:33
我也是出现这种现象啊，估计是连接出问题吧，片段太大的原因，你挑菌的时候菌长的怎么样，阳性克隆检测结果又怎么样呢？大片段的有时候连接不好，会出现这种问题。

那我想问问，你最后是怎么测出来的？我挑菌的时候菌长的挺壮的，比较分散，挑的菌都是单菌落，我挑的是白斑的菌，片段是有点大，那通过什么测出来呢？我把PCR产物送出去测序？谢谢！
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7楼2012-10-17 11:32:55
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yasmineross

铁虫 (小有名气)
是不是测序公司发错结果了？你的引物序列在测序结果中能找到吗？
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8楼2012-10-17 13:40:13
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yananhl

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yasmineross at 2012-10-17 13:40:13
是不是测序公司发错结果了？你的引物序列在测序结果中能找到吗？

我的引物序列能找到，但是找不到匹配的。测序结果不对。不知道是什么情况。
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9楼2012-10-17 14:50:23
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yananhl

银虫 (小有名气)
★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-18 18:46:53
引用回帖:
7楼: Originally posted by zishilanxuan at 2012-10-17 11:32:55
那我想问问，你最后是怎么测出来的？我挑菌的时候菌长的挺壮的，比较分散，挑的菌都是单菌落，我挑的是白斑的菌，片段是有点大，那通过什么测出来呢？我把PCR产物送出去测序？谢谢！...

实验不一样吧，我做的是基因步移，不过我的也是出现同种现象，而且我的特异性引物也能找到，但是就是找不到匹配的。我原来猜测是连接问题，前面连接问题大片段不行，后面换了酶后连接正常，但是今天出来测序结果还是不是自己正确的条带，目前也在纠结。PCR产物送出去测序要能保证条带单一，而且PCR产物测序也不是很准确，我也是在纠结这个问题，不好意思了，没有解决你的问题。我也是想解决这个问题。目前猜测是我的引物的问题。。。
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zishilanxuan
10楼2012-10-17 14:55:45
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