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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物直接测序，不出峰，啥原因？
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陈思容

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物直接测序，不出峰，啥原因？ 已有7人参与

如题，最近几个序列测序，PFU扩的，跑胶条带挺亮，结果测序公司说不出峰，要么就是杂乱无章，技术人员也说不出来所以然，急死人了
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1楼 2010-07-20 13:40:32
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~！
★ ★
陈思容(金币+5): 2010-07-20 16:50:50
1949stone(金币+2):正解 2010-07-20 16:52:19
我经常遇到这样的问题，现在基本上也没有什么好的解决办法，只是不断的重复，因为我要测序的样品太多，不可能全部做克隆，我一般是纯化后再送去测序，还会挑一两个纯化的样品来检测一下，看是否纯化成功，有些样品送去N次了还测不出来，就克隆，有时候我也会对别人测序公司发下牢骚，威胁说再测不出来再也不去他们那边测了，有可能是别人测序的不舍得加成本，加的试剂太少了……

总结，纯化后再送样;对测序公司施加压力;重复PCR几次再送样;实在做不出来的克隆……
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10楼2010-07-20 16:46:00
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普通回帖

liouwzh

木虫 (正式写手)
★
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-20 16:51:40
实在不行就做TA克隆之后再测序。
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2楼2010-07-20 14:32:15
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andyduan

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
3楼2010-07-20 14:44:13
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xiaoru2010

★
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-20 16:51:50
引用回帖:
Originally posted by 陈思容 at 2010-07-20 13:40:32:
如题，最近几个序列测序，PFU扩的，跑胶条带挺亮，结果测序公司说不出峰，要么就是杂乱无章，技术人员也说不出来所以然，急死人了

你的产物是用兼并引物扩的吗？是的话就很正常，说明产物里有大小相同或相近的但序列不同的不同基因，方法就是做克隆蓝白斑筛选后挑单菌落去测序，一个板上会测出不同的基因，我的就是这种情况，希望对你有帮助。
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4楼2010-07-20 15:09:56
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xiaoru2010 at 2010-07-20 15:09:56:

你的产物是用兼并引物扩的吗？是的话就很正常，说明产物里有大小相同或相近的但序列不同的不同基因，方法就是做克隆蓝白斑筛选后挑单菌落去测序，一个板上会测出不同的基因，我的就是这种情况，希望对你有帮助。

不是，特异性引物，平端链接比较麻烦
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5楼2010-07-20 16:04:25
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by andyduan at 2010-07-20 14:44:13:
做好克隆在测序比较好。一定要pcr产物测序吗

平端产物，做T-A克隆很费劲
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6楼2010-07-20 16:05:09
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by liouwzh at 2010-07-20 14:32:15:
实在不行就做TA克隆之后再测序。

平端产物，TA克隆相当麻烦
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7楼2010-07-20 16:06:06
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-20 16:52:04
杂峰应该是引物和引物带在作祟，解决办法就是用PCR纯化试剂盒纯化之后送去测序
但是我没有想明白不出峰是什么原因，是不是测序公司的问题啊，换一家试试
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8楼2010-07-20 16:23:00
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陈思容

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-20 16:23:00:
杂峰应该是引物和引物带在作祟，解决办法就是用PCR纯化试剂盒纯化之后送去测序
但是我没有想明白不出峰是什么原因，是不是测序公司的问题啊，换一家试试

恩，我感觉也是，P的条带很亮，怎么可能不出峰，还有就是有两个片段只是前面300bp的有峰，后面的完全是杂峰，让人崩溃
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9楼2010-07-20 16:27:53
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