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陈思容

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物直接测序,不出峰,啥原因? 已有7人参与

如题,最近几个序列测序,PFU扩的,跑胶条带挺亮,结果测序公司说不出峰,要么就是杂乱无章,技术人员也说不出来所以然,急死人了
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xp198766

铁杆木虫 (著名写手)

小木虫职业打酱油滴~~!

★ ★
陈思容(金币+5): 2010-07-20 16:50:50
1949stone(金币+2):正解 2010-07-20 16:52:19
我经常遇到这样的问题,现在基本上也没有什么好的解决办法,只是不断的重复,因为我要测序的样品太多,不可能全部做克隆,我一般是纯化后再送去测序,还会挑一两个纯化的样品来检测一下,看是否纯化成功,有些样品送去N次了还测不出来,就克隆,有时候我也会对别人测序公司发下牢骚,威胁说再测不出来再也不去他们那边测了,有可能是别人测序的不舍得加成本,加的试剂太少了……

总结,纯化后再送样;对测序公司施加压力;重复PCR几次再送样;实在做不出来的克隆……
10楼2010-07-20 16:46:00
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普通回帖

liouwzh

木虫 (正式写手)


1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-20 16:51:40
实在不行就做TA克隆之后再测序。
2楼2010-07-20 14:32:15
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andyduan

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

3楼2010-07-20 14:44:13
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xiaoru2010


1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-20 16:51:50
引用回帖:
Originally posted by 陈思容 at 2010-07-20 13:40:32:
如题,最近几个序列测序,PFU扩的,跑胶条带挺亮,结果测序公司说不出峰,要么就是杂乱无章,技术人员也说不出来所以然,急死人了

你的产物是用兼并引物扩的吗?是的话就很正常,说明产物里有大小相同或相近的但序列不同的不同基因,方法就是做克隆蓝白斑筛选后挑单菌落去测序,一个板上会测出不同的基因,我的就是这种情况,希望对你有帮助。
4楼2010-07-20 15:09:56
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陈思容

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by xiaoru2010 at 2010-07-20 15:09:56:

你的产物是用兼并引物扩的吗?是的话就很正常,说明产物里有大小相同或相近的但序列不同的不同基因,方法就是做克隆蓝白斑筛选后挑单菌落去测序,一个板上会测出不同的基因,我的就是这种情况,希望对你有帮助。

不是,特异性引物,平端链接比较麻烦
5楼2010-07-20 16:04:25
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陈思容

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by andyduan at 2010-07-20 14:44:13:
做好克隆在测序比较好。一定要pcr产物测序吗

平端产物,做T-A克隆很费劲
6楼2010-07-20 16:05:09
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陈思容

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by liouwzh at 2010-07-20 14:32:15:
实在不行就做TA克隆之后再测序。

平端产物,TA克隆相当麻烦
7楼2010-07-20 16:06:06
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yujiaping1

木虫 (著名写手)


1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-20 16:52:04
杂峰应该是引物和引物带在作祟,解决办法就是用PCR纯化试剂盒纯化之后送去测序
但是我没有想明白不出峰是什么原因,是不是测序公司的问题啊,换一家试试
8楼2010-07-20 16:23:00
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陈思容

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-20 16:23:00:
杂峰应该是引物和引物带在作祟,解决办法就是用PCR纯化试剂盒纯化之后送去测序
但是我没有想明白不出峰是什么原因,是不是测序公司的问题啊,换一家试试

恩,我感觉也是,P的条带很亮,怎么可能不出峰,还有就是有两个片段只是前面300bp的有峰,后面的完全是杂峰,让人崩溃
9楼2010-07-20 16:27:53
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