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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于克隆技术——pcr产物测序问题
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zishilanxuan

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by yananhl at 2012-10-17 14:55:45
实验不一样吧，我做的是基因步移，不过我的也是出现同种现象，而且我的特异性引物也能找到，但是就是找不到匹配的。我原来猜测是连接问题，前面连接问题大片段不行，后面换了酶后连接正常，但是今天出来测序结果还 ...

谢谢啊，咱俩互相试试吧，有结果了互相告诉一声，呵呵，谢谢
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11楼2012-10-17 15:27:07
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zishilanxuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yasmineross at 2012-10-17 13:40:13
是不是测序公司发错结果了？你的引物序列在测序结果中能找到吗？

我没找到
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12楼2012-10-17 15:27:30
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丢失固执

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
关于拟南芥转录因子AGL3的相关内容在哪里能找到啊，最好是中文的。。
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相信自己，坚持不懈
13楼2012-10-17 15:56:04
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yasmineross

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zishilanxuan at 2012-10-17 15:27:30
我没找到...

如果你的PCR产物是很单一且浓度高，纯化一下测个浓度100ng/ul左右送测序没有问题，2000的片段两个反应测不通，可以在中间加一条引物测一个反应。

或者你再送2个克隆去测序？
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14楼2012-10-18 11:15:35
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吴劲松

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-18 18:47:07
连接T载体后，单做PCR鉴定是不够的，因为非特异扩增的现象很普通的。应该提质粒做酶切鉴定。酶切正确后再送去测序。测序结果拿到后，先看你的引物序列是否在测序结果中。
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生命不息，奋斗不止
15楼2012-10-18 11:28:15
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吴劲松

新虫 (初入文坛)
其实你的这种情况，不适宜用PCR产物测序。原因很多，如果你的产物本来就不止一个序列，测序结果就非常乱。
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生命不息，奋斗不止
16楼2012-10-18 11:35:18
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zishilanxuan at 2012-10-16 19:46:31
我的目的基因大概在1910左右，加上引物，保守序列大概在2080多吧...

2000左右的片段应该很好做，我是做线粒体DNA的，要做很多全序列，目前用的较多的酶是奥赛博公司的酶，扩2—3kb没问题（甚至4kb都有可能）。如果PCR产物单一且条带较亮的话那就直接送测（克隆多费劲啊）；如果PCR产物单一但带比较暗的话，就多扩增点产物，之后自己纯化或者给测序公司纯化；至于克隆出的结果没有目的带，很正常，我也遇到过多次，我分析原因大多是目的片段没有连接进去，这里面可能与操作或者连接酶酶等有关系（还有挑选出的白斑也不一定是含目的片段的菌落，也可能是载体自连或者是假阳性，你如果放置4度冰箱一段时间的话可能会显示蓝色，只不过我们很多人都没有这一步），此外，测序结果在NCBI上比对没有匹配的，我想多多少少应该是有匹配的，比对的时候你可以选Somewhat similar sequences (blastn) ，还有就是你目的片段变异很大，目前NCBI上还没有提交这样的数据，也许楼主是第一个发现此变异的人，那就恭喜你咯！祝好！
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
17楼2012-10-19 09:28:19
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