应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于克隆技术——pcr产物测序问题
172/2返回列表上一页12
查看: 2369  |  回复: 16
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

zishilanxuan

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by yananhl at 2012-10-17 14:55:45
实验不一样吧，我做的是基因步移，不过我的也是出现同种现象，而且我的特异性引物也能找到，但是就是找不到匹配的。我原来猜测是连接问题，前面连接问题大片段不行，后面换了酶后连接正常，但是今天出来测序结果还 ...

谢谢啊，咱俩互相试试吧，有结果了互相告诉一声，呵呵，谢谢
赞一下 回复此楼
11楼2012-10-17 15:27:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zishilanxuan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yasmineross at 2012-10-17 13:40:13
是不是测序公司发错结果了？你的引物序列在测序结果中能找到吗？

我没找到
回复此楼
12楼2012-10-17 15:27:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

丢失固执

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
关于拟南芥转录因子AGL3的相关内容在哪里能找到啊，最好是中文的。。
赞一下 回复此楼
相信自己，坚持不懈
13楼2012-10-17 15:56:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yasmineross

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by zishilanxuan at 2012-10-17 15:27:30
我没找到...

如果你的PCR产物是很单一且浓度高，纯化一下测个浓度100ng/ul左右送测序没有问题，2000的片段两个反应测不通，可以在中间加一条引物测一个反应。

或者你再送2个克隆去测序？
赞一下 回复此楼
14楼2012-10-18 11:15:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

吴劲松

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-18 18:47:07
连接T载体后，单做PCR鉴定是不够的，因为非特异扩增的现象很普通的。应该提质粒做酶切鉴定。酶切正确后再送去测序。测序结果拿到后，先看你的引物序列是否在测序结果中。
赞一下 回复此楼
生命不息，奋斗不止
15楼2012-10-18 11:28:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

吴劲松

新虫 (初入文坛)
其实你的这种情况，不适宜用PCR产物测序。原因很多，如果你的产物本来就不止一个序列，测序结果就非常乱。
赞一下 回复此楼
生命不息，奋斗不止
16楼2012-10-18 11:35:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zishilanxuan at 2012-10-16 19:46:31
我的目的基因大概在1910左右，加上引物，保守序列大概在2080多吧...

2000左右的片段应该很好做，我是做线粒体DNA的，要做很多全序列，目前用的较多的酶是奥赛博公司的酶，扩2—3kb没问题（甚至4kb都有可能）。如果PCR产物单一且条带较亮的话那就直接送测（克隆多费劲啊）；如果PCR产物单一但带比较暗的话，就多扩增点产物，之后自己纯化或者给测序公司纯化；至于克隆出的结果没有目的带，很正常，我也遇到过多次，我分析原因大多是目的片段没有连接进去，这里面可能与操作或者连接酶酶等有关系（还有挑选出的白斑也不一定是含目的片段的菌落，也可能是载体自连或者是假阳性，你如果放置4度冰箱一段时间的话可能会显示蓝色，只不过我们很多人都没有这一步），此外，测序结果在NCBI上比对没有匹配的，我想多多少少应该是有匹配的，比对的时候你可以选Somewhat similar sequences (blastn) ，还有就是你目的片段变异很大，目前NCBI上还没有提交这样的数据，也许楼主是第一个发现此变异的人，那就恭喜你咯！祝好！
赞一下 回复此楼
TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
17楼2012-10-19 09:28:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 zishilanxuan 的主题更新
172/2返回列表上一页12
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:44 by XgCC8uTcwILl
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:42 by XgCC8uTcwILl
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:39 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:32 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:08 by XgCC8uTcwILl
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:05 by XgCC8uTcwILl
[硕博家园] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:56 by XgCC8uTcwILl
[论文投稿] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:56 by XgCC8uTcwILl
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 05:56 by XgCC8uTcwILl
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:50 by XgCC8uTcwILl
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 5/250 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 6/300 2026-09-27 05:42 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 PGTSwSC3F6nQ 2026-09-24 5/250 2026-09-25 11:19 by yhq9807
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 PGTSwSC3F6nQ 2026-09-24 7/350 2026-09-25 11:18 by yhq9807
[硕博家园] 上海工程技术大学 激光智能制造课题组 2027级博士研究生招生 +4 oxidpl 2026-09-20 6/300 2026-09-24 20:40 by oxidpl
[教师之家] 课题组招2027级博士 上海工程技术大学 激光智能制造方向 +4 oxidpl 2026-09-20 6/300 2026-09-24 20:37 by oxidpl
[基金申请] 师弟论文见刊大半年才想起来申请专利，还能抢救一下吗？ +4 13108017953 2026-09-21 4/200 2026-09-24 10:06 by kudofaye
[有机交流] 有机合成以后会不会被AI改变？做科研的虫友怎么看 +5 zapen 2026-09-20 8/400 2026-09-23 17:21 by tianxiaoxian
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭