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zishilanxuan

金虫 (小有名气)

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[求助] 关于克隆技术——pcr产物测序问题

各位大侠，我想请问一下，我从一种菌中P出来一条带，然后我进行胶回收，连接T载体，将连接产物转到感受态DH5α中，通过蓝白斑筛选，挑取白斑进行培养，能P出我胶回收的带，然后我把它送去测序，但测序结果不是我要的目的基因，而且测序结果在我菌的全序列里也没有匹配的，我想问一下，这是哪里出了问题啊？正常即使不是我的目的基因，是不是测出来的在我的全序列里也应该能有匹配的啊？希望大家能够帮我看看问题出在哪?

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1楼 2012-10-16 15:59:52

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南海所老龚

新虫 (正式写手)

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引用回帖:

4楼: Originally posted by zishilanxuan at 2012-10-16 19:46:31
我的目的基因大概在1910左右，加上引物，保守序列大概在2080多吧...

2000左右的片段应该很好做，我是做线粒体DNA的，要做很多全序列，目前用的较多的酶是奥赛博公司的酶，扩2—3kb没问题（甚至4kb都有可能）。如果PCR产物单一且条带较亮的话那就直接送测（克隆多费劲啊）；如果PCR产物单一但带比较暗的话，就多扩增点产物，之后自己纯化或者给测序公司纯化；至于克隆出的结果没有目的带，很正常，我也遇到过多次，我分析原因大多是目的片段没有连接进去，这里面可能与操作或者连接酶酶等有关系（还有挑选出的白斑也不一定是含目的片段的菌落，也可能是载体自连或者是假阳性，你如果放置4度冰箱一段时间的话可能会显示蓝色，只不过我们很多人都没有这一步），此外，测序结果在NCBI上比对没有匹配的，我想多多少少应该是有匹配的，比对的时候你可以选Somewhat similar sequences (blastn) ，还有就是你目的片段变异很大，目前NCBI上还没有提交这样的数据，也许楼主是第一个发现此变异的人，那就恭喜你咯！祝好！