| 查看: 2369 | 回复: 16 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
zishilanxuan金虫 (小有名气)
|
[求助]
关于克隆技术——pcr产物测序问题
|
||
| 各位大侠，我想请问一下，我从一种菌中P出来一条带，然后我进行胶回收，连接T载体，将连接产物转到感受态DH5α中，通过蓝白斑筛选，挑取白斑进行培养，能P出我胶回收的带，然后我把它送去测序，但测序结果不是我要的目的基因，而且测序结果在我菌的全序列里也没有匹配的，我想问一下，这是哪里出了问题啊？正常即使不是我的目的基因，是不是测出来的在我的全序列里也应该能有匹配的啊？希望大家能够帮我看看问题出在哪? |
回复此楼» 猜你喜欢
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有200人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
-
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
-
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析
已经有0人回复
-
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质控实录：从一张HPLC图谱读懂纯度与稳定性
已经有0人回复
|
2000左右的片段应该很好做，我是做线粒体DNA的，要做很多全序列，目前用的较多的酶是奥赛博公司的酶，扩2—3kb没问题（甚至4kb都有可能）。如果PCR产物单一且条带较亮的话那就直接送测（克隆多费劲啊）；如果PCR产物单一但带比较暗的话，就多扩增点产物，之后自己纯化或者给测序公司纯化；至于克隆出的结果没有目的带，很正常，我也遇到过多次，我分析原因大多是目的片段没有连接进去，这里面可能与操作或者连接酶酶等有关系（还有挑选出的白斑也不一定是含目的片段的菌落，也可能是载体自连或者是假阳性，你如果放置4度冰箱一段时间的话可能会显示蓝色，只不过我们很多人都没有这一步），此外，测序结果在NCBI上比对没有匹配的，我想多多少少应该是有匹配的，比对的时候你可以选Somewhat similar sequences (blastn) ，还有就是你目的片段变异很大，目前NCBI上还没有提交这样的数据，也许楼主是第一个发现此变异的人，那就恭喜你咯！祝好！ |
17楼2012-10-19 09:28:19
2楼2012-10-16 16:50:29
liuguilin 
禁言 (文学泰斗)
- 应助: 183 (高中生)
- 贵宾: 9.408
- 金币: 172475
- 散金: 3356
- 红花: 3586
- 沙发: 1
- 帖子: 317973
- 在线: 14660.7小时
- 虫号: 127894
- 注册: 2005-12-09
- 专业: 植物学研究的新技术、新方
3楼2012-10-16 17:15:10
zishilanxuan
金虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 528.5
- 散金: 16
- 帖子: 109
- 在线: 43.9小时
- 虫号: 1561451
- 注册: 2012-01-03
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2012-10-16 19:46:31
