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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » 线粒体基因控制区CR含重复序列，为什么PCR产物直接测序不准，而要纯化或者克隆再测序
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南海所老龚

新虫 (正式写手)

[求助] 线粒体基因控制区CR含重复序列，为什么PCR产物直接测序不准，而要纯化或者克隆再测序 已有1人参与

各位虫友好！
我是做鱼类线粒体基因的，提，问题如题：线粒体基因控制区CR含重复序列，为什么PCR产物直接测序不准，而要纯化或者克隆再测序？希望大家多交流，谢谢！
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
1楼 2012-08-27 09:22:08
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mitocam

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
测序当然要纯的底物才行。你的样品有不同的序列混在一起，怎么能够将各自的序列分别区别开？
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2楼2012-08-27 11:49:10
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR 过程中会产生一些非特异的产物，需要再次克隆将其筛除，尽管如此，你的测序产物也不可避免的含有你不想要的东东！！
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持之以恒、永不放弃！
3楼2012-08-27 12:30:55
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我个人觉得这个重复序列是你测序不准的原因，让公司在此区域设计测序引物进行双向测序，然后拼接，看看结果如何。
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生物化学与分子生物学
4楼2012-08-28 11:50:18
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lidonghong at 2012-08-28 11:50:18
我个人觉得这个重复序列是你测序不准的原因，让公司在此区域设计测序引物进行双向测序，然后拼接，看看结果如何。

是的，我的问题是为什么含重复序列就测不准呢？
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
5楼2012-08-29 08:47:15
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-08-27 12:30:55
PCR 过程中会产生一些非特异的产物，需要再次克隆将其筛除，尽管如此，你的测序产物也不可避免的含有你不想要的东东！！

谢谢应助，但是我的问题是为什么相对非控制区序列，含重复序列就测不准呢？
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6楼2012-08-29 08:48:50
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by mitocam at 2012-08-27 11:49:10
测序当然要纯的底物才行。你的样品有不同的序列混在一起，怎么能够将各自的序列分别区别开？

谢谢应助，但是我的问题是为什么相对非控制区序列，含重复序列就测不准呢？
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TheBestandMostBeautifulThingsintheWorldCan'tBeSeenorTouched,TheyMustBeFeltwithHeart.
7楼2012-08-29 08:49:03
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2012-08-29 08:47:15
是的，我的问题是为什么含重复序列就测不准呢？...

这就不是你的问题了，是现在所有测序公司的问题，只要含有重复序列就非常难测，你得详细请教测序公司，看看他们有啥好的方法没？
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生物化学与分子生物学
8楼2012-08-29 09:21:01
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南海所老龚

新虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lidonghong at 2012-08-29 09:21:01
这就不是你的问题了，是现在所有测序公司的问题，只要含有重复序列就非常难测，你得详细请教测序公司，看看他们有啥好的方法没？...

谢谢你，我弄明白了。
控制区首先变异比较大，测序时出现双峰或者套峰（因为变异同一个位置有多个碱基）；其次是含重复序列，且PCR产物里，拷贝数不一样，这样测序时测不准，如
ACGAATAATGTC(2个拷贝)
ACGAATAATAATGTC(3个拷贝)，测序时以2个拷贝为主呢还是3个拷贝呢，这就测不准了。
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9楼2012-08-29 09:24:32
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”

【答案】应助回帖

引用回帖:
6楼: Originally posted by 南海所老龚 at 2012-08-29 08:48:50
谢谢应助，但是我的问题是为什么相对非控制区序列，含重复序列就测不准呢？...

这是测序的技术问题，你可以和测序公司联系！
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持之以恒、永不放弃！
10楼2012-08-29 12:10:47
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