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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于构载体过程中PCR验证正确但是测序为空载体的困惑
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ztonyc

捐助贵宾 (初入文坛)

[求助] 关于构载体过程中PCR验证正确但是测序为空载体的困惑

各位好，
  我在构建3KB以上的片段上终载时，经常发现挑的克隆PCR鉴定大小正确，正负对照也都没问题。但是无论酶切或测序都发现是空载体。
  长片段可能构建上会有难度，但是我认为没构建成功应该PCR鉴定该位置也扩不出条带才对。为什么总能扩增出来？而且不同的构建确实P出的条带大小都符合实际的大小。难道未连接上的目的片段也能够转化进入大肠菌中？或者构上的载体有高级结构测序不出？
  小片段构建都没出现过这个问题，真的很想把原因搞清楚，求助于大家！！希望能得到大家的帮助！
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1楼 2013-10-05 15:08:58
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回帖置顶 ( 共有2个 )

John_Chen

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:03:29
gyesang: 回帖置顶 2013-10-06 02:03:32
建议：（1）用载体引物和目的片段引物一起扩增，不能只用目的片段引物扩增，好像未连接上的也可以转入大肠杆菌的。
（2）用菌液做PCR
（3）测序之前先用酶切鉴定几个PCR检测出的阳性克隆。
祝实验顺利！
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勤能补拙
4楼2013-10-05 19:30:16
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匿名

用户注销 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+5, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:04:18
gyesang: 回帖置顶 2013-10-06 02:04:20
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5楼2013-10-05 21:06:37
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DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-06 02:03:13
你可以比对下你做菌落pcr的和载体，说不定有很高的相似性。话说我7年前就遇到过这样的情况。
不知道你所谓的阴性对照是怎么设置的。
你的自连对照长出的菌pcr没有条带吗？
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2楼2013-10-05 18:48:48
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DAX1

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-05 18:48:48
你可以比对下你做菌落pcr的和载体，说不定有很高的相似性。话说我7年前就遇到过这样的情况。
不知道你所谓的阴性对照是怎么设置的。
你的自连对照长出的菌pcr没有条带吗？

第一句少说了，是做菌p的引物和载体对比
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3楼2013-10-05 18:49:29
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feilinshiji

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你把检测引物换成载体通用引物，比如T7-SP6、M13等等
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6楼2013-10-06 14:33:38
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
还有先挑克隆再菌液PCR吧，这样会比较靠谱。
菌落的问题 5楼说的很对
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7楼2013-10-07 11:14:07
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ztonyc

捐助贵宾 (初入文坛)
非常感谢各位！！
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8楼2013-10-08 09:49:38
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