24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 3457  |  回复: 7
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

ztonyc

捐助贵宾 (初入文坛)

[求助] 关于构载体过程中PCR验证正确但是测序为空载体的困惑

各位好,
  我在构建3KB以上的片段上终载时,经常发现挑的克隆PCR鉴定大小正确,正负对照也都没问题。但是无论酶切或测序都发现是空载体。
  长片段可能构建上会有难度,但是我认为没构建成功应该PCR鉴定该位置也扩不出条带才对。为什么总能扩增出来?而且不同的构建确实P出的条带大小都符合实际的大小。难道未连接上的目的片段也能够转化进入大肠菌中?或者构上的载体有高级结构测序不出?
  小片段构建都没出现过这个问题,真的很想把原因搞清楚,求助于大家!!希望能得到大家的帮助!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ztonyc

捐助贵宾 (初入文坛)

非常感谢各位!!
8楼2013-10-08 09:49:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 8 个回答

DAX1

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-06 02:03:13
你可以比对下你做菌落pcr的和载体,说不定有很高的相似性。话说我7年前就遇到过这样的情况。
不知道你所谓的阴性对照是怎么设置的。
你的自连对照长出的菌pcr没有条带吗?
2楼2013-10-05 18:48:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

DAX1

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by DAX1 at 2013-10-05 18:48:48
你可以比对下你做菌落pcr的和载体,说不定有很高的相似性。话说我7年前就遇到过这样的情况。
不知道你所谓的阴性对照是怎么设置的。
你的自连对照长出的菌pcr没有条带吗?

第一句少说了,是做菌p的引物和载体对比
3楼2013-10-05 18:49:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

John_Chen

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-06 02:03:29
gyesang: 回帖置顶 2013-10-06 02:03:32
建议:(1)用载体引物和目的片段引物一起扩增,不能只用目的片段引物扩增,好像未连接上的也可以转入大肠杆菌的。
(2)用菌液做PCR
(3)测序之前先用酶切鉴定几个PCR检测出的阳性克隆。
祝实验顺利!
勤能补拙
4楼2013-10-05 19:30:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 26申博 +3 加油冲啊! 2026-03-26 3/150 2026-03-27 15:38 by cls512
[考研] 274求调剂 +17 顾九笙要谦虚 2026-03-24 23/1150 2026-03-27 15:16 by caszguilin
[考研] 317求调剂 +5 十闲wx 2026-03-24 5/250 2026-03-27 13:48 by 杨杨杨紫
[考研] 303求调剂 +7 安忆灵 2026-03-22 8/400 2026-03-27 11:46 by sanrepian
[考研] 材料求调剂 +5 .m.. 2026-03-25 5/250 2026-03-27 11:08 by 不吃魚的貓
[考研] 071000生物学求调剂,初试成绩343 +6 小小甜面团 2026-03-25 6/300 2026-03-26 23:01 by 不吃魚的貓
[考研] 349求调剂 +4 李木子啊哈哈 2026-03-25 4/200 2026-03-26 22:49 by fmesaito
[考研] 333求调剂 +6 wfh030413@ 2026-03-23 6/300 2026-03-26 22:45 by 学员8dgXkO
[考研] 调剂 +4 柚柚yoyo 2026-03-26 4/200 2026-03-26 20:43 by fmesaito
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-26 6/300 2026-03-26 18:03 by 邱gl
[考研] 寻找调剂 +5 倔强芒? 2026-03-21 8/400 2026-03-26 13:25 by 0906ljy
[考研] 332求调剂 +6 032500 2026-03-25 6/300 2026-03-25 22:45 by 418490947
[考研] 求调剂 +3 QiMing7 2026-03-25 3/150 2026-03-25 21:13 by 给你你注意休息
[考研] 318求调剂 +5 plum李子 2026-03-21 8/400 2026-03-25 09:26 by aa331100
[考研] 化工专硕求调剂 +3 question挽风 2026-03-24 3/150 2026-03-24 18:48 by jhhcooi
[考研] 求调剂一志愿武汉理工大学材料工程(085601) +5 WW.' 2026-03-23 7/350 2026-03-24 14:50 by sprinining
[基金申请] 请教下大家 2026年国家基金申请是双盲审吗? +3 lishucheng1 2026-03-22 5/250 2026-03-24 08:22 by gltch
[考研] 333求调剂 +3 ALULU4408 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:04 by macy2011
[考研] 330求调剂0854 +3 assdll 2026-03-21 3/150 2026-03-21 13:01 by 搏击518
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
信息提示
请填处理意见