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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解?
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艾草104

铜虫 (初入文坛)

[求助] PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解? 已有3人参与

我在做载体构建，基因大小为1722bp,用的是EcoRI和XbaI两个酶切位点，保护碱基都是加的GAGAGA，随便加的。PCR出来了，片段大小看起来都没有什么问题。基因片段做EcoRI和XbaI的双酶切，从大小上看，应该都是切开了。然后做连接。连接用的是TAKARA的连接液，批号6022的那种，里面有SolutionI、SolutionII和SolutionIII。SolutionI是Enzyme Solution，Solution II是Concatenation Buffer, Solution III是Transformation Enhancer。转化的时候加SolutionIII就会长出菌落，但都是假阳性的，还特别多。不加SolutionII就长不出菌落来！各位，给我分析一下，到底是哪里出了问题。
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生活本是折磨，看透了，看懂了，接受了，才能叫享受
1楼 2014-06-03 14:15:02
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yudaoqian88

至尊木虫 (知名作家)

不良人

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-06-03 18:44:58
同样的问题，可以参考这个帖子，希望对你有所帮助：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6358938&authorid=1430329
目标片段扩增出来以后，先进行纯化，本人不太主张用胶回收方法纯化。如果条带特异，直接用试剂盒回收。如果条带不特异，把pcr产物作为模板再重复做一次扩增，得到较纯的条带后再回收。后者同时进行较回收，做平行试验。
回收后的片段俺比例与T载体混合，先做TA克隆，具体的加A什么的不详谈了。
连接产物转化后挑克隆，PCR检测，阳性菌液提取质粒酶切检测，然后送公司测序。
测序正确的阳性克隆再酶切后与目标载体进行载体构建，推荐利用酒精沉淀回收连接相结合的方法
祝楼主顺利！
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特别喜欢家门口开门的瞬间，宝宝那个高兴呀，蹦蹦跳跳，好不热闹！
4楼2014-06-03 16:06:31
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luwei13566

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 艾草104 at 2014-06-03 19:01:59
还是有疑问，如果说是保护碱基的问题，我师兄之前就是用的GAGAGA，一样的这两个酶切位点，两个基因都做出来了的，怎么解释啊！没有切开，是不是可以延长酶切时间...

1.添加的保护碱基也是对切割效率有影响的，有很多酶切位点外加CG就可以保证90%的切割率了，但是为了保险起见一般再多加2-3个，你师兄这样加的保护碱基可能更多的是从避免引物自身的颈环结构或者两引物匹配程度上考虑的，并不是说这样添加的保护碱基效率就一定很高，适当延长切割时间并多次重复试验一样可以做出来。
2.EcoRI在10*M buffer 中是有star活性的，不建议长时间切割。
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6楼2014-06-03 21:13:54
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caitlin0626

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-11 18:56:23
酶切连接操作应该都是用的标准化试剂吧，各种buffer酶啊什么的按量加就好了。另外，载体片段是不是带抗性的？别整出来一堆杂菌。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2014-06-03 14:30:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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艾草104: 金币+5, ★★★很有帮助, 我也正在考虑是不是保护碱基的问题，拿不定，谢谢！ 2014-06-03 16:22:53
1.你怎么通过肉眼判断你的基因就一定完全双酶切了呢？
2.假阳性多应该是你的基因和你的载体都没有完全双酶切，你把你双酶切处理的质粒不加基因做对照转化应该就有很多转化子。
3.XbaI的保护碱基与酶切位点相连的部分为   GC  TCTAGA   再往外的保护碱基随便加。 EcoRI也是如此。
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3楼2014-06-03 14:45:02
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艾草104

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-03 14:45:02
1.你怎么通过肉眼判断你的基因就一定完全双酶切了呢？
2.假阳性多应该是你的基因和你的载体都没有完全双酶切，你把你双酶切处理的质粒不加基因做对照转化应该就有很多转化子。
3.XbaI的保护碱基与酶切位点相连的部 ...

还是有疑问，如果说是保护碱基的问题，我师兄之前就是用的GAGAGA，一样的这两个酶切位点，两个基因都做出来了的，怎么解释啊！没有切开，是不是可以延长酶切时间
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5楼2014-06-03 19:01:59
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艾草104

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-03 21:13:54
1.添加的保护碱基也是对切割效率有影响的，有很多酶切位点外加CG就可以保证90%的切割率了，但是为了保险起见一般再多加2-3个，你师兄这样加的保护碱基可能更多的是从避免引物自身的颈环结构或者两引物匹配程度上考 ...

按照你的意思换掉了保护碱基，双酶切一个小时，酶切产物看着都还行，但是做完连接，连接产物跑了一个电泳，出现了一些奇怪的条带，没有我要的条带。载体片段大小约3600bp, PCR片段应为1748bp,EcoRI/XbaI双酶切后片段应为1730bp。看着上面的条带都像是连上了，所以做了一个转化，结果还是没有单克隆长出来。
高手，解释一下，帮帮忙！！！！
PCR片段连接载体，转化不出阳性克隆，求解?
N}Q]VGW0MW@FYZ9F{7HD@WH.jpg
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7楼2014-06-09 15:24:47
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luwei13566

木虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by 艾草104 at 2014-06-09 15:24:47
按照你的意思换掉了保护碱基，双酶切一个小时，酶切产物看着都还行，但是做完连接，连接产物跑了一个电泳，出现了一些奇怪的条带，没有我要的条带。载体片段大小约3600bp, PCR片段应为1748bp,EcoRI/XbaI双酶切后片 ...

LZ你能给我说说你的酶切图从左到右依次是什么吗？哪一个是你连接产物的双酶切检测？你载体和基因的连接比例和连接条件都是多少？？感受态细胞做过阳性对照没？其次建议下次酶切37度2h—3h。我至少用这两个酶切割2—3h没有出现star活性。
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8楼2014-06-09 20:23:06
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艾草104

铜虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-09 20:23:06
LZ你能给我说说你的酶切图从左到右依次是什么吗？哪一个是你连接产物的双酶切检测？你载体和基因的连接比例和连接条件都是多少？？感受态细胞做过阳性对照没？其次建议下次酶切37度2h—3h。我至少用这两个酶切割2— ...

第一张图是做的连接产物的核酸电泳，顺序是连接产物、重组质粒对照（与链接产物理论上大小很接近）、DNAmarker。第二张图顺序是PCR片段双酶切、PCR片段、载体双酶切、载体对照、DNAmarker。链接比例载体：基因片段~1：3.感受态做过阳性对照，是没有问题的。酶切时间是有点短，切了1个多点、小时。
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9楼2014-06-11 13:06:32
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艾草104

铜虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-09 20:23:06
LZ你能给我说说你的酶切图从左到右依次是什么吗？哪一个是你连接产物的双酶切检测？你载体和基因的连接比例和连接条件都是多少？？感受态细胞做过阳性对照没？其次建议下次酶切37度2h—3h。我至少用这两个酶切割2— ...

载体片段是从另一个构建好的质粒上切下来的，所以第二张图第三个泳道有一个接近2000bp的条带，上面那个大于3500bp的条带就是载体大片段。连接是4度过夜。
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10楼2014-06-11 13:10:19
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