| 查看: 3956 | 回复: 15 | |||
[交流]
感受态转化及阳性克隆出现问题 已有6人参与
|
|||
|
大肠杆菌DH5a感受态转化 1、从-70℃冰箱中取感受态细胞悬液,冰上解冻5min。 2、 加入连接产物10μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻弹匀,冰上放置30min。 3、42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3min。 4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃,100r/min摇床培养1h,使细菌恢复正常生长状态 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于LB平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 PCR验证阳性克隆 1.使用无菌白枪头将转化后长出的白色单菌落点种转移到含有氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养 2.挑取氨苄平板上的单菌落到含氨苄的LB液体培养基中，180rpm/min，37℃摇床培养3h 3.取2ml菌液作为PCR模板，PCR反应引物为T载体通用引物：RV-M和M13-17 4.PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，排除部分假阳性克隆片段 实验每次都是卡在PCR验证阳性克隆的第二步，37度摇床培养3h后培养基都很澄清，基本没有菌长出来，之前条白色单菌落到含氨苄的LB液体培养基中时，明显可以看到菌落接进去了呀，求大神帮帮忙看到底是哪里出了差错？？ |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有227人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 质粒非单克隆，怎么办？
已经有7人回复
- 胶回收产物连入克隆载体进行转化，结果第二天没有菌落长出。怎么回事儿？
已经有5人回复
- Top10感受态是dam阳性的吗
已经有5人回复
- 克隆转化，转化子就是不含目的基因。
已经有12人回复
- 转化后涂布，阴性对照培养皿上长有一两个菌落，能否继续在阳性平皿上挑单克隆？
已经有4人回复
- 令我崩溃的TA克隆，老是连不上
已经有33人回复
- 克隆方面的问题
已经有3人回复
- 连接转化假阳性提不出来质粒吗？
已经有8人回复
- 求助分子克隆问题——挑不出阳性克隆！
已经有14人回复
- 克隆基因，用PMD19-T载体转天根的感受态细胞，菌落少，测的序列全是空载体，求原因·
已经有21人回复
- T载体克隆做不出来，求帮助
已经有24人回复
- TA克隆电击法转化的步骤
已经有3人回复
- 转化后单克隆都一样吗
已经有13人回复
- 基因克隆过程中质粒、感受态细胞对氨苄的抗性
已经有9人回复
- 请教一下，这是否为假阳性克隆的问题，如果是，该如何提高阳性克隆效率？
已经有20人回复
- 阳性克隆的筛选问题
已经有15人回复
- 最近做T克隆都是阴性，怎么回事？
已经有14人回复
- 转化后阳性克隆长得比较慢是什么原因？！
已经有18人回复
- 大肠杆菌DH5α感受态制备
已经有21人回复
- 我将1质粒连在BK载体上，但是阳性克隆鉴定一直是阴性，什么原因呢
已经有6人回复
- 【专题】------------------感受态、转化专题------------------
已经有24人回复
- 做电转感受态时有染菌的吗
已经有15人回复
lairongpeng
银虫 (正式写手)
- 应助: 15 (小学生)
- 金币: 1163.6
- 散金: 58
- 红花: 1
- 帖子: 374
- 在线: 159小时
- 虫号: 2428081
- 注册: 2013-04-20
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传育种学
5楼2014-04-18 20:50:23
2楼2014-04-18 17:50:23
kueradi
金虫 (小有名气)
- 应助: 20 (小学生)
- 金币: 1441.5
- 红花: 2
- 帖子: 126
- 在线: 249.6小时
- 虫号: 2263328
- 注册: 2013-01-27
- 专业: 细胞死亡
4楼2014-04-18 20:09:06
周志惠
新虫 (小有名气)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1927.6
- 红花: 1
- 帖子: 195
- 在线: 211.4小时
- 虫号: 1781282
- 注册: 2012-04-26
- 专业: 微生物生理与生物化学
6楼2014-04-19 08:16:13
Neo2000
木虫 (著名写手)
- 应助: 639 (博士)
- 金币: 8720.2
- 红花: 37
- 帖子: 1700
- 在线: 269.3小时
- 虫号: 322365
- 注册: 2007-03-11
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
3楼2014-04-18 17:55:58
zhangtao110
银虫 (小有名气)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 25.3
- 红花: 1
- 帖子: 186
- 在线: 132.2小时
- 虫号: 2364241
- 注册: 2013-03-20
- 专业: 细胞信号转导
7楼2014-04-19 09:05:33
8楼2014-04-20 21:38:30
9楼2014-04-20 21:41:11
10楼2014-04-20 21:43:36
20