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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 感受态转化及阳性克隆出现问题
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银小耳

金虫 (小有名气)

[交流] 感受态转化及阳性克隆出现问题 已有6人参与

大肠杆菌DH5a感受态转化
1、从-70℃冰箱中取感受态细胞悬液,冰上解冻5min。
2、 加入连接产物10μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻弹匀,冰上放置30min。
3、42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3min。
4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃,100r/min摇床培养1h,使细菌恢复正常生长状态
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于LB平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
PCR验证阳性克隆
1.使用无菌白枪头将转化后长出的白色单菌落点种转移到含有氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养
2.挑取氨苄平板上的单菌落到含氨苄的LB液体培养基中，180rpm/min，37℃摇床培养3h
3.取2ml菌液作为PCR模板，PCR反应引物为T载体通用引物：RV-M和M13-17
4.PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，排除部分假阳性克隆片段

实验每次都是卡在PCR验证阳性克隆的第二步，37度摇床培养3h后培养基都很澄清，基本没有菌长出来，之前条白色单菌落到含氨苄的LB液体培养基中时，明显可以看到菌落接进去了呀，求大神帮帮忙看到底是哪里出了差错？？
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1楼 2014-04-18 16:10:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lairongpeng

银虫 (正式写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-19 13:36:18
摇菌3h本来就看不出来，但是菌液PCR是有结果的。建议您转化涂平板过夜，第二天长出来的单菌落直接接种到含有amp的1ml离心管中，37摄氏度150rpm，3h后取2ul PCR，阳性的话直接把离心管中剩下的菌液，一半用甘油保菌，一半送去测序。速度快，单克隆的概率高！
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5楼2014-04-18 20:50:23
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bestzdz

金虫 (小有名气)
★
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[ ????????? http://muchong.com/3g ]
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学海无涯，乐在其中；谨言慎行，惜时自勉！
2楼2014-04-18 17:50:23
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kueradi

金虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-19 13:36:09
第一个的5.和第二个的1.是重复吗？   5做完了直接挑克隆（含氨苄的平板），在液体氨苄培养基中摇即可，然后取1ul作为PCR模版即可。在氨苄固体平板中可以长出，而液体氨苄中不可以，那么是否你的固体平板中的氨苄失活？长出的是杂菌？
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4楼2014-04-18 20:09:06
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周志惠

新虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-19 13:36:30
大肠摇菌3小时确实不会有菌出，你这是连T载体，只要片段亮度不是很淡，应该不是问题，片段是用rTaq酶P的么？白色菌落也不一定就是阳性克隆
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6楼2014-04-19 08:16:13
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
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直接PCR检测试试，那个菌浓度不会太高

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3楼2014-04-18 17:55:58
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zhangtao110

银虫 (小有名气)
★
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用soc，营养高些，利于细胞壁的快速生成

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7楼2014-04-19 09:05:33
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银小耳

金虫 (小有名气)
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2?: Originally posted by bestzdz at 2014-04-18 17:50:23
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8楼2014-04-20 21:38:30
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银小耳

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by kueradi at 2014-04-18 20:09:06
第一个的5.和第二个的1.是重复吗？   5做完了直接挑克隆（含氨苄的平板），在液体氨苄培养基中摇即可，然后取1ul作为PCR模版即可。在氨苄固体平板中可以长出，而液体氨苄中不可以，那么是否你的固体平板中的氨苄失活 ...

第二个的1是为了验证第一个的5是抗性单克隆～我也怀疑固体平板中氨苄失活了，有验证方法吗？？
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9楼2014-04-20 21:41:11
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银小耳

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lairongpeng at 2014-04-18 20:50:23
摇菌3h本来就看不出来，但是菌液PCR是有结果的。建议您转化涂平板过夜，第二天长出来的单菌落直接接种到含有amp的1ml离心管中，37摄氏度150rpm，3h后取2ul PCR，阳性的话直接把离心管中剩下的菌液，一半用甘油保菌， ...

我离心了下～12000rmp,1.5min ,离心管底部几乎没有菌,好像根本没有长起来，难道是我T载体没连上，之前在平板上长的是杂菌？
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10楼2014-04-20 21:43:36
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