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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 请教一下，这是否为假阳性克隆的问题，如果是，该如何提高阳性克隆效率？

最近一直在做克隆，用的载体是TAKARA的PMD18-T，
克隆的DNA片段1100bp左右，为普通TAQ酶（非保真）扩增。
筛选蓝白斑后挑白斑做PCR快速鉴定很久都检测不到阳性结果（如图），然后听取网友建议将94的预变性时间改为10分钟，侥幸得到2个弱弱的条带，然后挑其他白斑重复均得不到有效结果。非常奇怪、原来做这种克隆一个星期以内绝对会出结果，随便挑斑就能出来。现在怎么这么难，挑了10-20个克隆还不能出现阳性。
弱弱问下各位帮忙分析下可能的原因在哪里？
如果是假阳性问题，那么怎么才能提高转化效率？

另外，一直不得解的是电泳图上方泳道口的带是什么？有人说是蛋白，但是蛋白也能被EB染色吗？

junye pcr.JPG



[ 来自科研家族 农业科研团队 ]
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1楼 2012-11-07 09:56:34
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

charles08

铁杆木虫 (著名写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by sxxuan at 2012-11-08 11:56:41
模板有没有问题？引物有没有问题？
用个效率高一点的酶，体系可能要优化一下。
pMD18-T其实挺多假阳性的。用自带的solutionI连接的话，连接体系中PCR回收产物如果浓度不高会降低连接效率，不妨放大体系到25ul，连 ...

谢谢，已经得到理想结果
要点是一要连接过夜，保证连接效率。
二是37度培养过夜即可，因为感受态不太好，时间过了即是卫星菌落
想想我平时挑的都是卫星菌落
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10楼2012-11-09 13:05:11
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
现在也遇到了类似的问题，以前3、4k的都能连上，现在2.5k的片段用保真或不保真的酶扩增，连接blunt载体或T载体，都连不上，PCR都扩不出条带，至今未找到原因，求高手现身
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jiayoubashaonian
2楼2012-11-07 10:02:10
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-11-07 10:02:10
现在也遇到了类似的问题，以前3、4k的都能连上，现在2.5k的片段用保真或不保真的酶扩增，连接blunt载体或T载体，都连不上，PCR都扩不出条带，至今未找到原因，求高手现身

我的也是，在原来那个实验室，克隆测序是很简单的，一星期内再怎么都会出来，现在是做了两个月了，找不到原因


区别我想原来只用的是通用引物，现在是自己设计的。难道这影响了连接效率？
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3楼2012-11-07 10:19:54
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rongduoyan

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-11-08 13:45:24
这你要从很多个方面去找原因了，引物，载体是否切开了 ，链接酶的效率，浓度，我觉得你现在可能是阳性率不高，可以把PCR产物浓度提高再试一下！至于跑不出孔的条带，很正常啦，菌液中的基因组DNA和蛋白缠绕在一起，就是这种效果图啦！呵呵，希望能帮上你的忙
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charles08
4楼2012-11-07 10:31:36
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by charles08 at 2012-11-07 10:19:54
我的也是，在原来那个实验室，克隆测序是很简单的，一星期内再怎么都会出来，现在是做了两个月了，找不到原因


区别我想原来只用的是通用引物，现在是自己设计的。难道这影响了连接效率？...

我一直用的通用引物也不行啊
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jiayoubashaonian
5楼2012-11-07 10:53:06
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
送鲜花一朵
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-11-08 13:45:34
引用回帖:
4楼: Originally posted by rongduoyan at 2012-11-07 10:31:36
这你要从很多个方面去找原因了，引物，载体是否切开了 ，链接酶的效率，浓度，我觉得你现在可能是阳性率不高，可以把PCR产物浓度提高再试一下！至于跑不出孔的条带，很正常啦，菌液中的基因组DNA和蛋白缠绕在一起， ...

可能真有这方面原因，我上次得到的两个阳性都是连接过夜才出来的。
PCR产物浓度的话我那都是按回收试剂盒的做的。弄不清的是原来实验室做的话，很容易出来

现在换个地方，参数都一样，就是出不来，很奇怪

我试试你说的办法，谢谢！
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6楼2012-11-07 10:55:25
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-11-07 10:53:06
我一直用的通用引物也不行啊...

那就不是这个问题，试试楼上说的，改变浓度，连接过夜看看
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7楼2012-11-07 11:02:55
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-11-08 13:45:45
模板有没有问题？引物有没有问题？
用个效率高一点的酶，体系可能要优化一下。
pMD18-T其实挺多假阳性的。用自带的solutionI连接的话，连接体系中PCR回收产物如果浓度不高会降低连接效率，不妨放大体系到25ul，连接过夜看看如何。
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charles08
你的日子如何，你的力量也必如何！
8楼2012-11-08 11:56:41
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liamliu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励交流 2012-11-09 14:28:26
如果你PCR得到的条带特异的话，可以不回收直接做连接，阳性克隆会更多一些，另外推荐使用全式金公司的平末端连接载体，连接得到的克隆数相比Takara要少些，但基本都是阳性克隆，Takara空质粒太多。
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9楼2012-11-09 11:39:02
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