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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 请教一下，这是否为假阳性克隆的问题?

最近一直在做克隆，用的载体是TAKARA的PMD18-T，
克隆的DNA片段1100bp左右，为普通TAQ酶（非保真）扩增。
筛选蓝白斑后挑白斑做PCR快速鉴定很久都检测不到阳性结果（如图），然后听取网友建议将94的预变性时间改为10分钟，侥幸得到2个弱弱的条带，然后挑其他白斑重复均得不到有效结果。非常奇怪、原来做这种克隆一个星期以内绝对会出结果，随便挑斑就能出来。现在怎么这么难，挑了10-20个克隆还不能出现阳性。
弱弱问下各位帮忙分析下可能的原因在哪里？
如果是假阳性问题，那么怎么才能提高转化效率？

另外，一直不得解的是电泳图上方泳道口的带是什么？有人说是蛋白，但是蛋白也能被EB染色吗？

junye pcr.JPG
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1楼 2012-11-07 10:25:24
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ciwei052

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
scelab: 金币+5, 谢谢交流 2012-11-07 22:34:18
前段时间我也有类似的情况，我的是感受态被污染了，污染菌（提质粒就会有很明显的感觉，它很粘稠，上下摇之后，气泡不容易消失）也能P出条带，但是相对较浅，但是比你的要深，挑菌时，要挑不是最大的，也不是最小的，相对中等，菌斑较为圆整的，多挑一些。
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2楼2012-11-07 22:23:27
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