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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我将1质粒连在BK载体上，但是阳性克隆鉴定一直是阴性，什么原因呢
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谢晨曦

金虫 (小有名气)

[求助] 我将1质粒连在BK载体上，但是阳性克隆鉴定一直是阴性，什么原因呢

我将1800b质粒连在BK载体上，转化每次长很多菌，但是阳性克隆鉴定一直是阴性，什么原因你呢我的感受态，酶，别人使用时都是可以做出结果。酶切位点是SAL1和ECORI，酶切过夜。求各位大侠指教，谢谢
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1楼 2012-03-22 15:52:49
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-11 13:42:42
你说转化之后长很多菌，而且感受态没问题很可能是酶切和连接出问题了，连接效率低。估计是载体或者片段酶切效果不好，载体没有完全被切开或者只是单酶切，这样转化的时候相当于转进去的还是质粒，涂板后会长很多甚至长满板。
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谢晨曦
2楼2012-04-11 09:17:08
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谢晨曦

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 超然渡陈 at 2012-04-11 09:17:08:
你说转化之后长很多菌，而且感受态没问题很可能是酶切和连接出问题了，连接效率低。估计是载体或者片段酶切效果不好，载体没有完全被切开或者只是单酶切，这样转化的时候相当于转进去的还是质粒，涂板后会长很多甚 ...

载体，我是从另一相同酶切位点，已经成功克隆的质粒上，双酶切后，胶回收来，请问，我应该怎么改善条件，进而克隆成功呢
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3楼2012-04-14 15:52:44
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-18 13:46:05
酶切用酶量和载体量要根据你所用的酶那家公司提供的说明来确定。载体超过一定量酶切会不彻底。而且在回收的时候电泳尽量时间久一点，最好让loading buffer 里的溴酚蓝前边一条带跑到胶的最下边，这样切好的和未充分酶切的会分的开一点。
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4楼2012-04-15 01:19:50
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ghs25372216

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
谢晨曦: 金币+1 2012-04-21 13:35:19
本帖内容被屏蔽
5楼2012-04-15 09:38:55
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谢晨曦

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ghs25372216 at 2012-04-15 09:38:55:
个人也是这么认为，阴性克隆，应该是你的连接环节出问题了吧，一般感受态多少还是没多大问题的，，建议你的连接产物进行琼脂糖凝胶电泳一下，看看是否连上了...

连接产物。20u体系，1u载体，9u片段，直接跑电泳吗？我试了一下什么也没看到呢
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6楼2012-04-18 11:42:46
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谢晨曦

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 超然渡陈 at 2012-04-15 01:19:50:
酶切用酶量和载体量要根据你所用的酶那家公司提供的说明来确定。载体超过一定量酶切会不彻底。而且在回收的时候电泳尽量时间久一点，最好让loading buffer 里的溴酚蓝前边一条带跑到胶的最下边，这样切好的和未充 ...

就是做的，但是没有效果呢
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7楼2012-04-18 11:44:12
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