应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我将1质粒连在BK载体上，但是阳性克隆鉴定一直是阴性，什么原因呢
71/1返回列表
查看: 2008  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

谢晨曦

金虫 (小有名气)

[求助] 我将1质粒连在BK载体上，但是阳性克隆鉴定一直是阴性，什么原因呢

我将1800b质粒连在BK载体上，转化每次长很多菌，但是阳性克隆鉴定一直是阴性，什么原因你呢我的感受态，酶，别人使用时都是可以做出结果。酶切位点是SAL1和ECORI，酶切过夜。求各位大侠指教，谢谢
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-03-22 15:52:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-11 13:42:42
你说转化之后长很多菌，而且感受态没问题很可能是酶切和连接出问题了，连接效率低。估计是载体或者片段酶切效果不好，载体没有完全被切开或者只是单酶切，这样转化的时候相当于转进去的还是质粒，涂板后会长很多甚至长满板。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

谢晨曦
2楼2012-04-11 09:17:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

谢晨曦

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 超然渡陈 at 2012-04-11 09:17:08:
你说转化之后长很多菌，而且感受态没问题很可能是酶切和连接出问题了，连接效率低。估计是载体或者片段酶切效果不好，载体没有完全被切开或者只是单酶切，这样转化的时候相当于转进去的还是质粒，涂板后会长很多甚 ...

载体，我是从另一相同酶切位点，已经成功克隆的质粒上，双酶切后，胶回收来，请问，我应该怎么改善条件，进而克隆成功呢
赞一下 回复此楼
3楼2012-04-14 15:52:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-18 13:46:05
酶切用酶量和载体量要根据你所用的酶那家公司提供的说明来确定。载体超过一定量酶切会不彻底。而且在回收的时候电泳尽量时间久一点，最好让loading buffer 里的溴酚蓝前边一条带跑到胶的最下边，这样切好的和未充分酶切的会分的开一点。
赞一下 回复此楼
4楼2012-04-15 01:19:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghs25372216

禁虫 (正式写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
谢晨曦: 金币+1 2012-04-21 13:35:19
本帖内容被屏蔽
5楼2012-04-15 09:38:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

谢晨曦

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ghs25372216 at 2012-04-15 09:38:55:
个人也是这么认为，阴性克隆，应该是你的连接环节出问题了吧，一般感受态多少还是没多大问题的，，建议你的连接产物进行琼脂糖凝胶电泳一下，看看是否连上了...

连接产物。20u体系，1u载体，9u片段，直接跑电泳吗？我试了一下什么也没看到呢
赞一下 回复此楼
6楼2012-04-18 11:42:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

谢晨曦

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 超然渡陈 at 2012-04-15 01:19:50:
酶切用酶量和载体量要根据你所用的酶那家公司提供的说明来确定。载体超过一定量酶切会不彻底。而且在回收的时候电泳尽量时间久一点，最好让loading buffer 里的溴酚蓝前边一条带跑到胶的最下边，这样切好的和未充 ...

就是做的，但是没有效果呢
赞一下 回复此楼
7楼2012-04-18 11:44:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 谢晨曦 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 5/250 2026-11-07 17:34 by Xc2FxHsHkBNc
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 2rKfVQg2jQww 2026-11-06 5/250 2026-11-07 17:23 by Xc2FxHsHkBNc
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 4/200 2026-11-07 16:50 by Xc2FxHsHkBNc
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 5sJFDKp2kwuI 2026-11-06 4/200 2026-11-07 16:28 by Xc2FxHsHkBNc
[教师之家] 延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容 +3 yexuqing 2026-11-04 5/250 2026-11-07 13:22 by 苏东坡二世
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +8 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 23/1150 2026-11-07 06:49 by Equinoxhua
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +10 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 22/1100 2026-11-06 17:18 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 5/250 2026-11-06 16:43 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 7/350 2026-11-06 16:43 by 5sJFDKp2kwuI
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +6 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-05 8/400 2026-11-06 16:34 by 5sJFDKp2kwuI
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:23 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 10/500 2026-11-06 16:12 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 11/550 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 12/600 2026-11-06 16:10 by 5sJFDKp2kwuI
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 11/550 2026-11-06 13:47 by BkA9Bi5cMhkD
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 ELBZ6WwEaRj6 2026-11-04 12/600 2026-11-06 05:32 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 7/350 2026-11-06 02:13 by qL1cU46YIdK0
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ttH3f1oA6ace 2026-11-04 9/450 2026-11-06 02:02 by qL1cU46YIdK0
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +6 ncTVBM6AOJHF 2026-11-04 10/500 2026-11-06 01:51 by qL1cU46YIdK0
[基金申请] 各位基础老师们，看完中央《从严治党》的决定后，对学术界更加有信心了吧 +5 iaeyuan 2026-11-01 5/250 2026-11-04 14:43 by jinchengzi
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭