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谢晨曦

金虫 (小有名气)

[求助] 我将1质粒连在BK载体上,但是阳性克隆鉴定一直是阴性,什么原因呢

我将1800b质粒连在BK载体上,转化每次长很多菌,但是阳性克隆鉴定一直是阴性,什么原因你呢我的感受态,酶,别人使用时都是可以做出结果。酶切位点是SAL1和ECORI,酶切过夜。求各位大侠指教,谢谢
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ghs25372216

禁虫 (正式写手)


感谢参与,应助指数 +1
谢晨曦: 金币+1 2012-04-21 13:35:19
本帖内容被屏蔽

5楼2012-04-15 09:38:55
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查看全部 7 个回答

超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-11 13:42:42
你说转化之后长很多菌,而且感受态没问题很可能是酶切和连接出问题了,连接效率低。估计是载体或者片段酶切效果不好,载体没有完全被切开或者只是单酶切,这样转化的时候相当于转进去的还是质粒,涂板后会长很多甚至长满板。

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2楼2012-04-11 09:17:08
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谢晨曦

金虫 (小有名气)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 超然渡陈 at 2012-04-11 09:17:08:
你说转化之后长很多菌,而且感受态没问题很可能是酶切和连接出问题了,连接效率低。估计是载体或者片段酶切效果不好,载体没有完全被切开或者只是单酶切,这样转化的时候相当于转进去的还是质粒,涂板后会长很多甚 ...

载体,我是从另一相同酶切位点,已经成功克隆的质粒上,双酶切后,胶回收来,请问,我应该怎么改善条件,进而克隆成功呢
3楼2012-04-14 15:52:44
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-18 13:46:05
酶切用酶量和载体量要根据你所用的酶那家公司提供的说明来确定。载体超过一定量酶切会不彻底。而且在回收的时候电泳尽量时间久一点,最好让loading buffer 里的溴酚蓝前边一条带跑到胶的最下边,这样切好的和未充分酶切的会分的开一点。
4楼2012-04-15 01:19:50
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