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感受态转化及阳性克隆出现问题 已有6人参与
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大肠杆菌DH5a感受态转化 1、从-70℃冰箱中取感受态细胞悬液,冰上解冻5min。 2、 加入连接产物10μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻弹匀,冰上放置30min。 3、42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3min。 4、向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃,100r/min摇床培养1h,使细菌恢复正常生长状态 5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于LB平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 PCR验证阳性克隆 1.使用无菌白枪头将转化后长出的白色单菌落点种转移到含有氨苄青霉素的平板上，37℃过夜培养 2.挑取氨苄平板上的单菌落到含氨苄的LB液体培养基中，180rpm/min，37℃摇床培养3h 3.取2ml菌液作为PCR模板，PCR反应引物为T载体通用引物：RV-M和M13-17 4.PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，排除部分假阳性克隆片段 实验每次都是卡在PCR验证阳性克隆的第二步，37度摇床培养3h后培养基都很澄清，基本没有菌长出来，之前条白色单菌落到含氨苄的LB液体培养基中时，明显可以看到菌落接进去了呀，求大神帮帮忙看到底是哪里出了差错？？ |
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