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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌DH5α感受态制备
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yousliyun

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌DH5α感受态制备

连续做了3次大肠杆菌DH5α感受态，转化后一个斑也没长，找不到是什么原因。
菌株用的是买的天根大肠杆菌DH5α感受态细胞，直接画线，摇菌，在操作过程中Cacl2可能多加了点，其他没什么大问题。
希望帮忙分析一下，是什么原因哪？快做崩溃了。
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1楼2012-04-05 14:34:13
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 可以考虑一下 2012-04-06 09:06:53
用感受态细胞划线培养，摇菌，应该没什么问题，因为我们实验室有人这样干过，做出来的细胞效率也很高的，不过你用的是买来的感受态细胞，我就不能肯定了。而且我也不知道楼主用的是那个protocol做的感受态，我用过inoue法和hanahan法，前者效率更高一点。实在不行可以换方法做。
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好好学习，天天向上！
7楼2012-04-05 21:52:12
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普通回帖

ICDC

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励新虫 2012-04-05 18:34:07
不知lz转化的是质粒还是片段？质粒是闭合环状，很难被宿主的RE系统降解，转化效率自然很高。

lz为什么不直接用购买的感受态做转化呢？还非得自己制备？

另：如果追求高效率的话，可以尝试电转，操作简单，转化效率高。
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2楼2012-04-05 15:06:41
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yuluoqiutong

木虫 (正式写手)

初出茅庐

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励新虫积极交流 2012-04-05 18:34:21
买的感受态再拿来做感受态的话，效果可能没有用菌种做的好，我们也试过，转化效果很差。不过有时是因为你的质粒。我们做的时候用TFN BUFFER,不是单纯的Cacl2,效果比较好。你可以试试。
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3楼2012-04-05 15:39:00
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
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西瓜: 金币+2, 确实应该先拿质粒检测下感受态的效率 2012-04-05 18:35:16
嗯·.........................
我觉得还是用常用的阳性质粒检测一下吧，我们一般用pBSK+/-，这种质粒转化后一般一涂一大板，如果这都出不来的话那就是你的感受态制作有问题，或者转化有问题，制作感受态时尽量低温操作哦
希望有所帮助 若有说错请高手指点哦
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Let God do with it as He wills
4楼2012-04-05 15:42:25
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
刚看到你拿感受态再划线..............
有这样的吗
制感受态的菌一般都尽量不要传代和冻融的...........
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Let God do with it as He wills
5楼2012-04-05 15:45:24
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励积极交流哦 2012-04-06 09:06:32
做好的感受态应该涂一个阴性（随便加种抗性：AMP）和一个阳性（无抗性的平板）的试验板。先把买来的感受态接种摇过夜，第二天转接后制作感受态，现在很流行用TSS法做，效果很好
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活到老学到老
6楼2012-04-05 21:40:57
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wzqno

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是你板子的问题，抗生素加多了？试试涂个阳性菌/////或者一个菌种，我用的top10感觉很不错
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8楼2012-04-05 21:52:14
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telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
★
西瓜: 金币+1, 谢谢捧场~ 2012-04-06 12:12:00
DH5α感受态细胞  和DH5α菌是两回事！
你说的不太清楚，没看明白。

至于CaCL2多加不是问题，他们有的超级感受态的制作就是CaCl2多加的。我倒是没亲自多加过，但说的人应该不会骗我。用过他们那个，是比我们的长的多。
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
9楼2012-04-05 22:43:44
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小白虾

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流~帅哥啊 2012-04-06 12:12:16
买来的感受态是不能再画线培养制备感受台的
他们对出售的感受态进行过改造，无法使用；我们实验室之前也做过，效果特别不好
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飞的更高
10楼2012-04-05 22:49:13
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