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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌DH5α感受态制备
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yousliyun

新虫 (初入文坛)

[求助] 大肠杆菌DH5α感受态制备

连续做了3次大肠杆菌DH5α感受态，转化后一个斑也没长，找不到是什么原因。
菌株用的是买的天根大肠杆菌DH5α感受态细胞，直接画线，摇菌，在操作过程中Cacl2可能多加了点，其他没什么大问题。
希望帮忙分析一下，是什么原因哪？快做崩溃了。
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1楼 2012-04-05 14:34:13
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萝卜丝儿

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 可以考虑一下 2012-04-06 09:06:53
用感受态细胞划线培养，摇菌，应该没什么问题，因为我们实验室有人这样干过，做出来的细胞效率也很高的，不过你用的是买来的感受态细胞，我就不能肯定了。而且我也不知道楼主用的是那个protocol做的感受态，我用过inoue法和hanahan法，前者效率更高一点。实在不行可以换方法做。
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好好学习，天天向上！
7楼2012-04-05 21:52:12
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ICDC

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励新虫 2012-04-05 18:34:07
不知lz转化的是质粒还是片段？质粒是闭合环状，很难被宿主的RE系统降解，转化效率自然很高。

lz为什么不直接用购买的感受态做转化呢？还非得自己制备？

另：如果追求高效率的话，可以尝试电转，操作简单，转化效率高。
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2楼2012-04-05 15:06:41
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yuluoqiutong

木虫 (正式写手)

初出茅庐

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励新虫积极交流 2012-04-05 18:34:21
买的感受态再拿来做感受态的话，效果可能没有用菌种做的好，我们也试过，转化效果很差。不过有时是因为你的质粒。我们做的时候用TFN BUFFER,不是单纯的Cacl2,效果比较好。你可以试试。
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3楼2012-04-05 15:39:00
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 确实应该先拿质粒检测下感受态的效率 2012-04-05 18:35:16
嗯·.........................
我觉得还是用常用的阳性质粒检测一下吧，我们一般用pBSK+/-，这种质粒转化后一般一涂一大板，如果这都出不来的话那就是你的感受态制作有问题，或者转化有问题，制作感受态时尽量低温操作哦
希望有所帮助 若有说错请高手指点哦
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Let God do with it as He wills
4楼2012-04-05 15:42:25
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