| 查看: 2245 | 回复: 12 | ||
[求助]
克隆转化，转化子就是不含目的基因。
|
|
我的目的基因是750bp，质粒载体是PET-24a。 我从我师兄的菌提取质粒，然后用KOD酶PCR目的基因。 然后两步酶切质粒和目的基因。NdeI酶切，胶回收，再BamHI酶切，再回收。酶切时间是3个小时以上。 提质粒、PCR、回收后都有电泳检测，条带位置正确。 然后用东洋纺的高效链接液链接目的基因和质粒的酶切片段。连接时间大概时2个小时以上。 转化到感受态细胞JM109，热击法。 然后培养在含Kan+的平板上。 第一次没有长，第二次4个平板，只有一个平板上长了3个，第三次，4个平板上都有，每个大约3—5个。 PCR检测，都没有P出目的片段。 想请教下各位大神，大概会是什么问题，那些地方需要改进。 |
回复此楼» 猜你喜欢
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有213人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
317分 一志愿江南大学 化学工程学硕 求调剂
已经有6人回复
-
化工申博
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 大片段基因组DNA克隆，有好方法的进来讨论下
已经有3人回复
- 酵母转化验证方法
已经有15人回复
- 克隆基因，用PMD19-T载体转天根的感受态细胞，菌落少，测的序列全是空载体，求原因·
已经有21人回复
- 为什么扩了一个抗性基因，连到载体上，这个基因没有表达呢，跪求各个大牛指导！！！
已经有17人回复
- TA克隆电击法转化的步骤
已经有3人回复
- 转化后单克隆都一样吗
已经有13人回复
- 长片段基因3.9K克隆不出来，求助
已经有43人回复
- pET28a与目的基因连接后转化长满菌
已经有9人回复
- 真菌转化子PCR验证问题
已经有20人回复
- 目的基因连接到克隆载体后提取质粒测序，序列有问题
已经有11人回复
- 目的基因的连接与转化
已经有3人回复
- 转化真菌后，怎么鉴定转化子？目的基因是从该真菌克隆出来的
已经有5人回复
- 基因工程课程小结
已经有20人回复
- 如何把质粒转入大肠杆菌中？
已经有13人回复
- 目的基因连接pGEX-6p-1进行转化的问题
已经有14人回复
- 亲们~谁做过酿酒酵母的转化，怎么筛选阳性克隆呢？
已经有5人回复
- 克隆基因和载体连接后转化至大肠杆菌，为什么每次涂板都是空平板没有菌落？
已经有17人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌有的是表达载体的宿主，有些事克隆载体的宿主，他们的区别在哪�
已经有10人回复
- 【求助/交流】pET29a转化E.coli BL21
已经有4人回复
- 【求助/交流】目的基因克隆总不成功
已经有5人回复
charles08
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 5803.3
- 散金: 2103
- 红花: 27
- 帖子: 1933
- 在线: 603.8小时
- 虫号: 823046
- 注册: 2009-08-06
- 性别: GG
- 专业: 植物病理学
2楼2013-11-04 23:30:40
machao8405
木虫 (正式写手)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 6292
- 散金: 31
- 红花: 4
- 帖子: 740
- 在线: 216.3小时
- 虫号: 884679
- 注册: 2009-10-26
- 性别: GG
- 专业: 植物学
3楼2013-11-04 23:33:51
4楼2013-11-05 13:34:12
5楼2013-11-05 13:35:59
charles08
铁杆木虫 (著名写手)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 5803.3
- 散金: 2103
- 红花: 27
- 帖子: 1933
- 在线: 603.8小时
- 虫号: 823046
- 注册: 2009-08-06
- 性别: GG
- 专业: 植物病理学
6楼2013-11-05 16:29:35
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
林默泪: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-06 19:24:07
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 19:51:56
感谢参与，应助指数 +1
林默泪: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-11-06 19:24:07
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 19:51:56
|
我的目的基因是750bp，质粒载体是PET-24a。 我从我师兄的菌提取质粒，然后用KOD酶PCR目的基因。 然后两步酶切质粒和目的基因。NdeI酶切，胶回收，再BamHI酶切，再回收。酶切时间是3个小时以上。 提质粒、PCR、回收后都有电泳检测，条带位置正确。 然后用东洋纺的高效链接液链接目的基因和质粒的酶切片段。连接时间大概时2个小时以上。 转化到感受态细胞JM109，热击法。 然后培养在含Kan+的平板上。 第一次没有长，第二次4个平板，只有一个平板上长了3个，第三次，4个平板上都有，每个大约3—5个。 PCR检测，都没有P出目的片段 从你描述来看,pET载体应该是双酶切完全了.(但是一般情况下要注意 载体上两个酶切位点之间的片段有多长?胶回收的时候有没有看到切出来的片段? 如果载体没切干净,那可能会长出很多载体自连的假克隆.) 你的问题很可能出在PCR产物的酶切. 首先,你的引物5'端加了保护碱基吗?如果没有,酶切会变得相对困难. 第二,BamHI 不太好切, 而且你的酶切时间是3小时左右,所以很可能PCR产物上的BamHI没切动或者效率很低. 有一个麻烦点的办法是,你先把PCR产物连接到T-载体上,(如果没有T-载体,随便找个载体,,酶切,补平然后去磷,PCR产物加磷,用平末端连接),然后再从T-载体上把你的目的基因用NdeI和BamHI 切下来,这样做你就能确定目的基因的两端肯定是切开了的. 如果还长不出克隆,那就不是酶切,连接的问题了(当然,你要确定你的感受态细胞是正常的) |
7楼2013-11-06 17:24:24
liaohongbin
金虫 (初入文坛)
- 应助: 4 (幼儿园)
- 金币: 533.5
- 帖子: 47
- 在线: 87.8小时
- 虫号: 1332790
- 注册: 2011-06-28
- 性别: GG
- 专业: 金属结构材料
8楼2013-11-06 17:32:56
9楼2013-11-06 19:14:08
10楼2013-11-06 19:24:40
