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林默泪

新虫 (初入文坛)

[求助] 克隆转化,转化子就是不含目的基因。

我的目的基因是750bp,质粒载体是PET-24a。
我从我师兄的菌提取质粒,然后用KOD酶PCR目的基因。
然后两步酶切质粒和目的基因。NdeI酶切,胶回收,再BamHI酶切,再回收。酶切时间是3个小时以上。
提质粒、PCR、回收后都有电泳检测,条带位置正确。
然后用东洋纺的高效链接液链接目的基因和质粒的酶切片段。连接时间大概时2个小时以上。
转化到感受态细胞JM109,热击法。
然后培养在含Kan+的平板上。
第一次没有长,第二次4个平板,只有一个平板上长了3个,第三次,4个平板上都有,每个大约3—5个。
PCR检测,都没有P出目的片段。

想请教下各位大神,大概会是什么问题,那些地方需要改进。
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machao8405

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
感受态的问题?不加抗生素,不热激直接图一个板试试

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2013-11-04 23:33:51
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流! 2013-11-05 00:31:43
提提质粒酶切看看


最好用快速内切酶,不用依次酶切,浪费不少时间
2楼2013-11-04 23:30:40
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林默泪

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by machao8405 at 2013-11-04 23:33:51
感受态的问题?不加抗生素,不热激直接图一个板试试

这个对照做过,没有问题。
4楼2013-11-05 13:34:12
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林默泪

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by charles08 at 2013-11-04 23:30:40
提提质粒酶切看看


最好用快速内切酶,不用依次酶切,浪费不少时间

转化子提质粒酶切吗?
什么是快速内切酶?
因为买的酶不是一家公司的,没办法用通用buffer双酶切。
5楼2013-11-05 13:35:59
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