应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 真菌转化子PCR验证问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
211/3返回列表123下一页
查看: 2358  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

碧海行帆

金虫 (初入文坛)

[求助] 真菌转化子PCR验证问题

跟大家探讨一个问题，我做真菌的基因敲除，目前得到了24个转化子，进行PCR验证的时候，抗性基因也就是阳性对照成功扩出，要敲除的目的基因都没有扩出，按理说应该是都敲除了，但转化率达到了100%，大家说有这种可能吗？？？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
硕士毕业去找工作
1楼 2013-01-05 17:35:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
碧海行帆: 金币+1 2013-01-07 10:45:31
你用抗性做筛选标记，假的都死了，出来假的才不对吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
2楼2013-01-05 20:36:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
碧海行帆: 金币+4 2013-01-07 10:46:10
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:51:20
如果有抗性基因而要敲除的基因还在的话才有问题，那说明不能用抗性基因来筛选目的基因了。此外，我觉得你最好不要用PCR负结果来证明敲除基因不在了，应该用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR，确定突变株的带（含抗性基因）位置和野生型不同，并且不含野生型的带。
赞一下 回复此楼
3楼2013-01-06 02:27:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

碧海行帆

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2013-01-05 20:36:31
你用抗性做筛选标记，假的都死了，出来假的才不对吧。

嗯，但也有抗性基因转进去了，目的基因没转进去的情况啊
赞一下 回复此楼
硕士毕业去找工作
4楼2013-01-06 11:43:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

碧海行帆

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 02:27:42
如果有抗性基因而要敲除的基因还在的话才有问题，那说明不能用抗性基因来筛选目的基因了。此外，我觉得你最好不要用PCR负结果来证明敲除基因不在了，应该用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR，确定突变株的带（含抗性 ...

嗯，有道理，我用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR验证了，但结果是非特异性条带，没有单一的条带，而且目的基因扩增了很多次均为扩出，所以说我现在很疑惑啊
赞一下 回复此楼
硕士毕业去找工作
5楼2013-01-06 11:46:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xj8442cn

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
碧海行帆: 金币+1 2013-01-07 10:46:26
能文献你用的什么真菌，什么报告基因，什么筛选标记么？真菌比较特殊，假阳性非常多，问题还需详细些，真菌100%转化效率是不可能的。
赞一下 回复此楼
6楼2013-01-06 13:03:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

haiwoshishui

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
碧海行帆: 金币+2 2013-01-07 10:46:45
碧海行帆: 金币+1 2013-01-08 15:00:27
我的基因敲除300多个转化子才有16株是敲除的。你怎么才得到这么少的转化子并且都是敲除的呢？可以做杂交进一步验证一下。PS：你要不要做回补实验？有木有合适的回补载体？我正为回补载体的事犯愁呢。
赞一下 回复此楼
7楼2013-01-06 13:25:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-01-06 11:46:15
嗯，有道理，我用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR验证了，但结果是非特异性条带，没有单一的条带，而且目的基因扩增了很多次均为扩出，所以说我现在很疑惑啊...

你说的非特异条带是在野生型还是突变株里扩出来的？是引物的问题吗？你敲除的目的基因是否有其它同源基因呢？
赞一下 回复此楼
8楼2013-01-06 13:58:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

碧海行帆

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by xj8442cn at 2013-01-06 13:03:23
能文献你用的什么真菌，什么报告基因，什么筛选标记么？真菌比较特殊，假阳性非常多，问题还需详细些，真菌100%转化效率是不可能的。

我做的是镰刀菌，用潮霉素做筛选标记，目的基因PCR了很多次，都扩不出，但野生型能扩出，觉得奇怪啊
赞一下 回复此楼
硕士毕业去找工作
9楼2013-01-06 17:54:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

碧海行帆

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by haiwoshishui at 2013-01-06 13:25:40
我的基因敲除300多个转化子才有16株是敲除的。你怎么才得到这么少的转化子并且都是敲除的呢？可以做杂交进一步验证一下。PS：你要不要做回补实验？有木有合适的回补载体？我正为回补载体的事犯愁呢。

你是如何验证的啊，做了几次PCR呀？我的载体是老师管别人要的
赞一下 回复此楼
硕士毕业去找工作
10楼2013-01-06 17:59:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 碧海行帆 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 工科求调剂 +13 11ggg 2026-04-03 13/650 2026-04-05 05:26 by houyaoxu
[考研] 294求调剂 +6 Grey_Ey 2026-04-02 9/450 2026-04-04 22:07 by hemengdong
[考研] 材料调剂 +10 懒羊羊轻置玉臀 2026-04-02 11/550 2026-04-04 21:56 by laoshidan
[考研] 一志愿华中农业大学0710（A）初试329分 求调剂 +3 一名26考研生 2026-04-04 3/150 2026-04-04 17:10 by dongzh2009
[考研] 一志愿南农090401，268，求调剂 +5 一木鸟然 2026-04-04 5/250 2026-04-04 17:07 by babysonlkd
[考研] 291求调剂 +4 迷蒙木木 2026-04-01 5/250 2026-04-04 15:59 by sihailian3
[考研] 一志愿东北大学085901土木专硕345求调剂 +3 zxt11111 2026-04-04 3/150 2026-04-04 14:21 by 土木硕士招生
[考研] 本9一志愿2 0854低分专硕286求调剂 +9 芒种111 2026-04-04 9/450 2026-04-04 11:01 by tangruihua
[考研] 求调剂，一志愿郑州大学材料与化工专硕，英二数二342分，求老师收留 +17 v12abo 2026-04-02 19/950 2026-04-04 09:16 by 来看流星雨10
[考研] 电子信息调剂交叉学科有推荐吗 +6 jhtfeybgj 2026-04-01 8/400 2026-04-04 07:52 by 1753564080
[考研] 322求调剂 +6 FZAC123 2026-04-03 6/300 2026-04-03 22:23 by 科研小专家
[考研] 一志愿中国石油大学化学工程323分求调剂 +4 化工专硕323分 2026-04-03 6/300 2026-04-03 22:12 by dongzh2009
[考研] 求调剂 +4 压力??大 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:36 by 啵啵啵0119
[考研] 一志愿华中农业071010，总分320求调剂 +7 困困困困坤坤 2026-04-02 7/350 2026-04-03 17:26 by Yuena_Wang
[考研] 求调剂机会 +5 意染ivy 2026-04-03 5/250 2026-04-03 15:13 by qoooooo614
[考研] 346求调剂 +5 郑诚乐 2026-04-02 5/250 2026-04-02 16:38 by SZW_UJN
[考研] 0710生物学，325求调剂 +3 mkkkkkl 2026-04-01 3/150 2026-04-02 09:48 by Jaylen.
[考研] 求调剂，一志愿南京师范大学计算机专硕，初试373，六级通过， +3 计算机追梦人 2026-04-01 3/150 2026-04-02 07:57 by fxue1114
[考研] 262求调剂 +9 励志一定发文章 2026-03-31 10/500 2026-04-01 12:22 by sunshine0013
[考研] 0855机械初试280求调剂 +3 kazenotori 2026-03-31 3/150 2026-04-01 10:08 by JourneyLucky
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭