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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 13:58:21
你说的非特异条带是在野生型还是突变株里扩出来的?是引物的问题吗?你敲除的目的基因是否有其它同源基因呢?...

非特异性带是突变株扩出来的,是做上下游验证用的,不是扩目的基因,引物换过了,还是一样啊。
硕士毕业去找工作
11楼2013-01-06 18:02:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-01-06 18:02:56
非特异性带是突变株扩出来的,是做上下游验证用的,不是扩目的基因,引物换过了,还是一样啊。...

你是说野生型是单一条带,但突变株是很多杂带?杂带中有野生型的条带吗?上个图分析一下吧。
12楼2013-01-07 02:42:44
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 02:42:44
你是说野生型是单一条带,但突变株是很多杂带?杂带中有野生型的条带吗?上个图分析一下吧。...

12.11.26(zhuanhuazi xiayou yanzheng-2).jpg(14.74KB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4Dfbg2B3qUAQA2e6?p=130497
第一道为mark 第2道到第6道为5个转化子做下游验证,最亮的和我要的目的带大小类似,但杂带很多,大家看一下,后面那五条带是在不同温度下做到
硕士毕业去找工作
13楼2013-01-07 09:05:44
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-01-07 09:05:44
12.11.26(zhuanhuazi xiayou yanzheng-2).jpg(14.74KB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4Dfbg2B3qUAQA2e6?p=130497
第一道为mark 第2道到第6道为5个转化子做下游验证,最亮的和我要的目的带大小类似,但杂带很多, ...

没有野生对照吗?这些杂带包括野生的带么?还有我怀疑你PCR时候的模板量太大,所以特异性不行。你用了多少DNA模板?
14楼2013-01-07 11:22:56
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
14楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 11:22:56
没有野生对照吗?这些杂带包括野生的带么?还有我怀疑你PCR时候的模板量太大,所以特异性不行。你用了多少DNA模板?...

第六道为野生型,最亮的带应该符合下游验证的大小,DNA的浓度都是提完后,加30-100ul,用的时候再稀释10倍,以前都是这么做的啊,能留下QQ进步交流下吗
硕士毕业去找工作
15楼2013-01-07 14:47:12
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


碧海行帆: 金币+1 2013-01-08 14:59:38
引用回帖:
15楼: Originally posted by 碧海行帆 at 2013-01-07 14:47:12
第六道为野生型,最亮的带应该符合下游验证的大小,DNA的浓度都是提完后,加30-100ul,用的时候再稀释10倍,以前都是这么做的啊,能留下QQ进步交流下吗...

野生型的带也杂,确定引物没问题吗?是否优化了退火温度?模板最好做个定量,上100ng左右PCR。不要超过500ng。如果你不能定量,可以做几个稀释不同的模板浓度,试试看能不能去掉杂带。
PS: 我不用QQ的。
16楼2013-01-08 08:15:37
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songna1987

新虫 (初入文坛)

我也是做敲除,也是用潮霉素做筛选,得到了一百多个转化子,用潮霉素筛选都能长,但是PCR就是没检测到,我也很奇怪呢,既然能抗潮霉素为什么检测不到呢?
17楼2013-05-11 21:39:13
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mengyf1983

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 02:27:42
如果有抗性基因而要敲除的基因还在的话才有问题,那说明不能用抗性基因来筛选目的基因了。此外,我觉得你最好不要用PCR负结果来证明敲除基因不在了,应该用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR,确定突变株的带(含抗性 ...

你好,我也在做真菌的基因敲除,在抗性培养基上长出二十三个菌株,我用被敲除基因片段中的约300bp的引物去验证,用标准株做阳性对照,结果发现抗性培养基上长的菌株都有阳性结果,也就说目的基因片段未被敲除。这是怎么回事呢?这个实验师兄以前做过也成功验证过,可是我这个为什么失败呢?求大侠指点迷津!
18楼2013-06-18 21:05:02
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mengyf1983

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
17楼: Originally posted by songna1987 at 2013-05-11 21:39:13
我也是做敲除,也是用潮霉素做筛选,得到了一百多个转化子,用潮霉素筛选都能长,但是PCR就是没检测到,我也很奇怪呢,既然能抗潮霉素为什么检测不到呢?

不知道楼主发下你是什么原因了吗?
19楼2013-06-18 21:06:51
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克隆大虾

铁杆木虫 (著名写手)

都是随机插入..
20楼2013-06-18 21:19:06
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