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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 真菌转化子PCR验证问题
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

[求助] 真菌转化子PCR验证问题

跟大家探讨一个问题，我做真菌的基因敲除，目前得到了24个转化子，进行PCR验证的时候，抗性基因也就是阳性对照成功扩出，要敲除的目的基因都没有扩出，按理说应该是都敲除了，但转化率达到了100%，大家说有这种可能吗？？？
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硕士毕业去找工作
1楼 2013-01-05 17:35:48
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mengyf1983

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 02:27:42
如果有抗性基因而要敲除的基因还在的话才有问题，那说明不能用抗性基因来筛选目的基因了。此外，我觉得你最好不要用PCR负结果来证明敲除基因不在了，应该用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR，确定突变株的带（含抗性 ...

你好，我也在做真菌的基因敲除，在抗性培养基上长出二十三个菌株，我用被敲除基因片段中的约300bp的引物去验证，用标准株做阳性对照，结果发现抗性培养基上长的菌株都有阳性结果，也就说目的基因片段未被敲除。这是怎么回事呢？这个实验师兄以前做过也成功验证过，可是我这个为什么失败呢？求大侠指点迷津！
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18楼2013-06-18 21:05:02
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
碧海行帆: 金币+1 2013-01-07 10:45:31
你用抗性做筛选标记，假的都死了，出来假的才不对吧。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2013-01-05 20:36:31
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
碧海行帆: 金币+4 2013-01-07 10:46:10
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 16:51:20
如果有抗性基因而要敲除的基因还在的话才有问题，那说明不能用抗性基因来筛选目的基因了。此外，我觉得你最好不要用PCR负结果来证明敲除基因不在了，应该用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR，确定突变株的带（含抗性基因）位置和野生型不同，并且不含野生型的带。
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3楼2013-01-06 02:27:42
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2013-01-05 20:36:31
你用抗性做筛选标记，假的都死了，出来假的才不对吧。

嗯，但也有抗性基因转进去了，目的基因没转进去的情况啊
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硕士毕业去找工作
4楼2013-01-06 11:43:47
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