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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 真菌转化子PCR验证问题
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)

[求助] 真菌转化子PCR验证问题

跟大家探讨一个问题，我做真菌的基因敲除，目前得到了24个转化子，进行PCR验证的时候，抗性基因也就是阳性对照成功扩出，要敲除的目的基因都没有扩出，按理说应该是都敲除了，但转化率达到了100%，大家说有这种可能吗？？？
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硕士毕业去找工作
1楼2013-01-05 17:35:48
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by zhaodahe at 2013-01-05 20:36:31
你用抗性做筛选标记，假的都死了，出来假的才不对吧。

嗯，但也有抗性基因转进去了，目的基因没转进去的情况啊
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硕士毕业去找工作
4楼2013-01-06 11:43:47
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
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3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 02:27:42
如果有抗性基因而要敲除的基因还在的话才有问题，那说明不能用抗性基因来筛选目的基因了。此外，我觉得你最好不要用PCR负结果来证明敲除基因不在了，应该用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR，确定突变株的带（含抗性 ...

嗯，有道理，我用敲除基因序列两端的DNA序列做PCR验证了，但结果是非特异性条带，没有单一的条带，而且目的基因扩增了很多次均为扩出，所以说我现在很疑惑啊
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硕士毕业去找工作
5楼2013-01-06 11:46:15
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by xj8442cn at 2013-01-06 13:03:23
能文献你用的什么真菌，什么报告基因，什么筛选标记么？真菌比较特殊，假阳性非常多，问题还需详细些，真菌100%转化效率是不可能的。

我做的是镰刀菌，用潮霉素做筛选标记，目的基因PCR了很多次，都扩不出，但野生型能扩出，觉得奇怪啊
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硕士毕业去找工作
9楼2013-01-06 17:54:09
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
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7楼: Originally posted by haiwoshishui at 2013-01-06 13:25:40
我的基因敲除300多个转化子才有16株是敲除的。你怎么才得到这么少的转化子并且都是敲除的呢？可以做杂交进一步验证一下。PS：你要不要做回补实验？有木有合适的回补载体？我正为回补载体的事犯愁呢。

你是如何验证的啊，做了几次PCR呀？我的载体是老师管别人要的
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硕士毕业去找工作
10楼2013-01-06 17:59:57
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-06 13:58:21
你说的非特异条带是在野生型还是突变株里扩出来的？是引物的问题吗？你敲除的目的基因是否有其它同源基因呢？...

非特异性带是突变株扩出来的，是做上下游验证用的，不是扩目的基因，引物换过了，还是一样啊。
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硕士毕业去找工作
11楼2013-01-06 18:02:56
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
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12楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 02:42:44
你是说野生型是单一条带，但突变株是很多杂带？杂带中有野生型的条带吗？上个图分析一下吧。...

12.11.26(zhuanhuazi xiayou yanzheng-2).jpg(14.74KB)
http://kuai.xunlei.com/d/LnU4Dfbg2B3qUAQA2e6?p=130497
第一道为mark 第2道到第6道为5个转化子做下游验证，最亮的和我要的目的带大小类似，但杂带很多，大家看一下，后面那五条带是在不同温度下做到
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硕士毕业去找工作
13楼2013-01-07 09:05:44
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碧海行帆

金虫 (初入文坛)
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14楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-07 11:22:56
没有野生对照吗？这些杂带包括野生的带么？还有我怀疑你PCR时候的模板量太大，所以特异性不行。你用了多少DNA模板？...

第六道为野生型，最亮的带应该符合下游验证的大小，DNA的浓度都是提完后，加30-100ul，用的时候再稀释10倍，以前都是这么做的啊，能留下QQ进步交流下吗
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硕士毕业去找工作
15楼2013-01-07 14:47:12
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