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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » ITS1和ITS4做样品体系中真菌菌株鉴定，为啥PCR产物竟然是2个条带？
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在雨中

金虫 (著名写手)

[求助] ITS1和ITS4做样品体系中真菌菌株鉴定，为啥PCR产物竟然是2个条带？

RT，对土壤样品中的真菌菌株鉴定，除了已知某菌株PCR为单一明亮条带外，其他土壤样品的DNA提取物用ITS1和ITS4这对引物扩增在500-700bp大都有2个目标条带。。。。什么情况？
这样的PCR产物能够拿去克隆测序吗？
将500-700bp的两个条带都切胶回收，可以克隆测序吗？请高手指点。
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1楼 2012-05-21 16:15:02
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回帖置顶 ( 共有1个 )

qyunpeng

铁杆木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
在雨中: 回帖置顶 2012-05-22 09:50:30
在雨中: 金币+100, ★★★★★最佳答案, 谢谢。您是高手哇 2012-05-22 09:50:42
1.不同真菌的ITS片段大小是不一样的，大小在500-750bp之间，个别在1000左右
2.土壤样品的DNA提取物用ITS1和ITS4这对引物扩增在500-750bp大都有2个目标条带是正常的，因为土壤中的真菌种类很多，所以条带会多，而且普通电泳无法区分，所以用切胶回收做克隆测序的话，也会得到很多真菌，而不是单一的，我觉得做克隆测序是可以的
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2楼2012-05-21 19:09:13
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jerryzyy

金虫 (小有名气)
我想请教一下楼主，你做真菌PCR的体系和程序是什么啊，我也在做这个，一直都没出结果，想借鉴一下楼主的
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6楼2012-09-02 09:06:26
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匿名

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10楼2013-06-12 17:11:01
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霸_霸

新虫 (初入文坛)
我也做真菌这个区扩增，有时候因为菌不纯会得到两个不同片段，大多还是一个条带，
还有就是 我想请问你个问题，我在pcr过程中对于某些真菌有时会p不出来，可能是dna提取的问题，你遇到过吗？
你dna是怎么提的？
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3楼2012-06-12 14:55:17
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muchong5577

金虫 (正式写手)
能多和你们交流吗？我最近也在做这个。
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4楼2012-06-12 17:33:26
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小浣熊静静

铁虫 (初入文坛)
感兴趣！
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5楼2012-07-03 15:48:09
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在雨中

金虫 (著名写手)
★
wizardfan: 金币+1, 谢谢分享经验 2012-09-03 04:03:05
引用回帖:
6楼: Originally posted by jerryzyy at 2012-09-02 09:06:26
我想请教一下楼主，你做真菌PCR的体系和程序是什么啊，我也在做这个，一直都没出结果，想借鉴一下楼主的

常规的程序呀，文献中多的是。
55°退火，50s；72°延伸 50s；35cycles
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7楼2012-09-02 13:16:45
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zhsp07

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 霸_霸 at 2012-06-12 14:55:17
我也做真菌这个区扩增，有时候因为菌不纯会得到两个不同片段，大多还是一个条带，
还有就是 我想请问你个问题，我在pcr过程中对于某些真菌有时会p不出来，可能是dna提取的问题，你遇到过吗？
你dna是怎么提的？

请教一下，我正在做植物根部内生真菌的多样性，也是用ITS做的，用巢式PCR扩增ITS，扩出来也是两条带分别在600bp（很暗）和750bp（较亮），但是选用的阳性对照都只有一条带，而且长度都在600bp左右，所以比较纠结，请问你遇到过类似的问题吗？
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车到山前必有路!
8楼2013-04-16 16:54:50
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匿名

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9楼2013-06-12 17:09:34
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